Введение. Сердечно-сосудистые заболевания занимают первое место в структуре заболеваемости и смертности,  и являются важной медицинской и социальной проблемой [1]. Среди смертельных случаев в Российской Федерации доля ишемической болезни сердца составляет 25.7%, инсультов – 21.4% [2].

В связи с такой далеко неутешительной статистикой существует необходимость в современных инновациях для лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Для достижения этой цели, необходимо дальнейшее развитие фундаментальных исследований, целью которых является изменение эндогенного потенциала сердечно-сосудистой системы [3].

Основной задачей лечения сердечно-сосудистых заболеваний является улучшение прогноза заболевания, предупреждение развития осложнений, увеличение продолжительности и улучшение качества жизни, также важно обратить внимание на поиск новых кардио- и церебропротекторных препаратов [4, 5].

Производные 3-оксипиридинового ряда имеют широкий спектр биологических эффектов. Среди них обнаружены соединения, которые обладают антигипоксической, антиоксидантной активностью, оригинальный спектр нейротропного действия лекарственных препаратов на уровне нейронов (анксиолитический, антистрессовый, противосудорожный, церебропротекторный, противопаркинсонический, антиамнестический и противоалкогольный), улучшают мозговое кровообращение, ингибируют агрегацию тромбоцитов, увеличивают антитромбогенный потенциал крови, снижают общий уровень холестерина, оказывают кардиопротекторный и антиатеросклеротическый эффекты. Таким образом, целесообразно искать потенциальные кардио- и церебропротективные средства среди производных оксипиридинового ряда [3, 6]. В последние годы активно изучаются лекарственные средства этилметилгидроксипиридина сукцинат и тиотриазолин.

Этилметилмеркаптопиридина сукцинат ингибирует свободно-радикальные процессы окисления липидов и оказывает модулирующее действие на активность связанных с мембраной ферментов и ионных каналов [7, 8]. Выявлено, что этилметилгидроксипиридина сукцинат не оказывает влияния на активность трипсиноподобных, цистеиновых протеиназ и их эндогенных ингибиторов в экстракте мозговой ткани крысы in vitro [9]. Однако, способность этилметилгидроксипиридина сукцината воздействовать на активность протеолитических ферментов и их эндогенных ингибиторов в ткани головного мозга и сыворотке недостаточно изучена [10].

Цель исследования. Изучить влияние препаратов этилметилгидроксипиридина сукцинат и тиотриазолин на интенсивность протеолиза в экстракте ткани головного мозга и сыворотке крови крыс in vitro.

Материалы и методы.

Дизайн исследования включал несколько этапов:

1. Выделение лейкоцитов.
2. Окрашивание прижизненными красителями.
3. Флюоресцентная микроскопия.
4. Анализ результатов методом статистической обработки.

В каждую ячейку 24 луночного планшета добавляли 500 мкл полученной суспензии лейкоцитов, поверх которой добавляли 500 мкл питательной среды RPMI-1640 с глутамином (ПанЭко) – контрольная группа 6 лунок.

В качестве отрицательного контроля использовали 10% раствор формалина – 6 лунок. Для моделирования гипоксии использовали масло Oil for Tissue Culture (для тканевых культур) (SAGE, США), которое вносилось в лунки в количестве 500 мкл поверх питательной среды с глутамином – 6 лунок.

В качестве тестируемого препарата использовался этилметигидроксипиридина сукцинат или препарат с торговой маркой Мексиприм в концентрации 0.01 моль/л, без гипоксии – 6 лунок и с гипоксией – 6 лунок.

Культивирование клеток осуществляли в течении 8 часов в СО₂-инкубаторе, заполненном газовой смесью (95% воздуха + 5% СО₂), при температуре 37ºС и относительной влажности 100%.

Оценку жизнеспособности клеток проводили с использованием двухкомпонентного красителя, включающего 2µМ calcein-AM (Sigma-Aldrich, США) и 4µМ Ethidium bromide (Sigma-Aldrich, США). Регистрацию флуоресценции живых и мертвых клеток проводили при помощи микроскопа EclipseTi-S (Nikon, Япония), увеличение х20.

Процент жизнеспособных клеток рассчитывали по формуле: количество мертвых клеток / (количество живых клеток + количество мертвых клеток) х100% [11].

Для подсчета количества клеток использовали специализированное программное обеспечение программу EZ-C1 FreeViewer Ver3.90 (Nikon, Япония).

Статистический анализ производился с помощью программного обеспечения StatSoft STATISTICA 10.0.

Результаты и их обсуждение.  В ходе эксперимента при сравнении статистических данных в представленных исследуемых группах были установлены достоверные статистические различия количества клеток.

Четко прослеживаются достоверные различия в сравнительном количестве клеток в группах (рис. 1):

1. Контроль положительный.
2. Контроль отрицательный (с 10% р-ом формалина).
3. Контроль (гипоксия).
4. Контроль положительный + Мексиприм.
5. Контроль (гипоксия) + Мексиприм.

Были установлены достоверные различия (при р<0.01) между группой №1 (положительный контроль) и группами №2 (отрицательный контроль, 10% раствора формалина) №3 (модель гипоксии) со снижением количества жизнеспособных клеток.

Так жизнеспособность клеток во №2 (132.27%) и №3 (130.91%) снижалась по сравнению с №1 группой – 146.82%, что свидетельствует о цитотоксическом эффекте.

На ряду с этим в группе №4 (156.36%) и группе №5 (153.18%) процент жизнеспособных клеток был больше по сравнению с группой №1 и имел достоверные различия (при р<0.01), что свидетельствует о стимулирующем и антигипоксическом эффекте препарата Мексиприм, добавленного в культуральную среду.

Примечание: №1 – положительный контроль, №2 – отрицательный контроль (с 10% р-ом формалина), №3 – условия гипоксии, №4 –Мекспиприм 0,01 моль/л в нормальных условиях; №5 – Мексиприм 0,01 моль/л в условиях гипоксии. * - р<0.05.

Note: №1 – positive control, №2 – negative control (with 10% pth formalin), №3 – conditions of hypoxia, №4 – Mexiprim 0.01 mol/l under normal conditions; №5 – Meciprim 0.01 mol/l under hypoxic conditions. * - p <0.05.

Рис.1. Результаты эксперимента in vitro

Fig.1. The results of the in vitro experiment

В ходе эксперимента было установлено: количество живых клеток в группе №1 (положительный контроль) составляло 46.82±8.15, мертвых – 23.64±5.52; в группе №2 (отрицательный контроль, 10% раствора формалина) – живых клеток – 32.27±5.18; мертвых – 40.91±7.69; в группе №3 (модель гипоксии) – живых клеток – 30.91±3.75, мертвых – 35.45±10.60; в группе №4 (добавление Мексиприма 0.01 моль/л) живых клеток – 56.36±6.36, мертвых клеток 31.82±4.05; в группе №5 (добавление Мексиприма 0.01 моль/л при гипоксии) количество живых клеток составило 53.18±7.17, мертвых клеток 35.45±4.72.

О стимулирующем антигипоксическом эффекте препарата Мексиприм, добавленного в культуральную среду. свидетельствует процент жизнеспособных клеток в группе 4 (Мексиприм) и группе 5 (Мексиприм+гипоксия) по сравнению с группой №1 (контроль) и имел достоверные различия (при р<0.01).

Заключение. Таким образом, в ходе проведенного исследования установлено, что предложенный метод оценки антигипоксической активности in vitro с использованием в качестве препарата-референса этилметилгидроксипиридина сукцината актуально при скрининге инновационных молекул.

В отношении данной статьи не было зарегистрировано конфликта интересов.