Введение. Первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ) относится к одной из самых распространенных и тяжелых форм заболеваний глаз, приводящих к слепоте и инвалидности. [1]. Среди всех видов глауком на долю ПОУГ приходиться от 72,3 до 96,1% [2]. ПОУГ – хроническое заболевание, характеризующееся  прогрессирующей и необратимой  дегенерацией клеток ганглиозного слоя, входящего в состав зрительного нерва и слоя нервных волокон сетчатой оболочки [3]. Следует отметить, что мужской пол является фактором риска развития глаукомы - данное заболевание встречается у мужчин в 65% [4]. Особенностью ПОУГ является бессимптомное течение и довольно сложная и трудоемкая диагностика на начальных стадиях, поэтому выявление данного заболевания в большинстве случаев происходит на стадиях, сопровождающихся уже необратимыми изменениями зрительного нерва [5]. ПОУГ – одна из главных причин слабовидения и слепоты среди лиц трудоспособного возраста в развитых странах [6].

Установлено, что в формировании ПОУГ важное значение имеют матриксные металлопротеиназы (далее ММР). ММР вовлечены  в патогенез различных типов глаукомы [7-10], их содержание существенно выше в глаукоматозных глазах [11]. Матриксные металлопротеиназы участвуют в регуляции оттока внутриглазной жидкости [12]. По сравнению со здоровыми глазами, содержание ММР-2 и -9 существенно выше в глаукоматозных глазах. Эти изменения были обнаружены в водянистой влаге, радужно-роговичный углу и теноновой капсуле у пациентов с первичной открытоугольной глаукомой, первичной закрытоугольной глаукомой и эксфолиативной глаукоме [13, 14]. Повышение содержания металлопротеиназы-9 как в системном кровотоке, так и местно также может свидетельствовать о нарушении процессов клеточного ремоделирования в структурах глаза, что способствует формированию аутоиммунного воспаления с деструкцией тканей [15]. Наибольшее значение в формировании ПОУГ имеют ММР-1 и ММР -9 [16, 17].

Генетические исследования  ПОУГ активно проводятся как зарубежными научными коллективами, так и российскими учеными [18-21]. Исследуется вовлеченность генов матриксных металлопротеиназ в формирование глаукомы. Так, в проведенном Golubnitschaja O. et. al. исследовании установлено, что экспрессия генов тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ ММР-9 и ММР-14 была повышена у пациентов с нормотензивной глаукомой  по сравнению с контрольной группой [22]. Aung T et. al. изучали полиморфизм rs2664538 гена ММР- 9 у 217 пациентов с ПЗУГ и 83 индивидуумов контрольной группы в Китае [23]. Markiewicz L. et. al. провели анализ ассоциаций полиморфных локусов -1607 1G / 2G ММР-1, -1562 C / T ММР-9, -82 A / G ММР-12, C / T IL-1β -511 и 372 T / C TIMP1 с возникновением ПОУГ и исследовали их влияние на основные клинические признаки глаукомы [24]. В результате исследования, проведенного Micheal S. et. al.  обнаружено, что у мужчин фактором риска ПЗУГ является полиморфизм rs17576 (c.836A> G) гена ММР-9, который у женщин не играл существенной роли [25]. Следует отметить, что в Российской Федерации изучение роли полиморфизма генов MMP в развитии ПОУГ до последнего  времени не проводилось.

Цель исследования. Изучить вклад ген-генных взаимодействий полиморфных локусов матриксных металлопротеиназ в подверженность к первичной открытоугольной глаукомы у мужчин.

Материалы и методы исследования. Выборка для исследования включала 236 мужчин с ПОУГ (диагноз был подтвержден клиническими, инструментальными и лабораторными методами обследования) и 176 мужчин контрольной группы, не имеющих данного заболевания. Все мужчины, включенные в данное исследование, являлись уроженцами  Центрального Черноземья Российской Федерации (Курская, Белгородская, Воронежская, Липецкая области), имели русскую национальность и не находились в родстве друг с другом [18, 19]. Диагноз глаукома был поставлен согласно следующих диагностических критериев: повышение ВГД, вид глаукоматозной экскавации ДЗН при офтальмоскопии, изменения периферического поля зрения, специфичные для глаукомы. Обследование обеих групп было проведено в офтальмологическом отделении ОГБУЗ Белгородской областной клинической больницы им. Святителя Иоасафа (Белгород) и офтальмологическом центре «Поколение» (Старый Оскол).

Группа контроля была сформирована из индивидуумов мужского пола, не имеющих острых и хронических заболеваний глаз, у которых отсутствовали какие-либо признаки глаукомы  –  ВГД было ниже 21 при пневматической тонометрии, отсутствовала глаукоматозная экскавация диска зрительного нерва и периферическое поле зрения было в пределах нормы. Также они не имели тяжелых соматических патологий, в том числе приводящих к поражениям глаз.

Все исследования пациентам проводились только после их информированного согласия на использование персональных и лечебно- диагностических данных для научно-исследовательских целей, полученных в ходе госпитализации.

         Средний возраст пациентов с ПОУГ составил 70,5± 4,8 лет, контрольной группы – 69,7 ± 5,2 лет (p>0,05). Более половины больных ПОУГ (52,6%) имели сопутствующие заболевания других органов и систем, в группе контроля – 48,1%. При оценке  индекса массы тела больные ПОУГ не отличались от группы контроля: у больных ПОУГ – 27,99±4,82, варьировал от 16,4 до 47,3, у пациентов из контрольной группы – 28,21±5,70, варьировал от 17,93 до 51,4 (р=0,59).

Для молекулярно-генетического исследования были отобраны 8 полиморфных локусов генов матриксных металлопротеиназ rs3918249, rs3787268, rs2250889, rs17577, rs17576, rs3918242 гена ММР-9, rs1799750 гена ММР-1, rs679620 гена ММР-3 с учетом их значимого влияния на экспрессию и регуляторный  потенциал генов [26].

Анализ полиморфных маркеров осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе CFX96. Генотипирование проводилось в режиме реального времени методом TаqMаn зондов. Использовались наборы реагентов для генотипирования полиморфных локусов  rs3918249, rs3787268, rs2250889, rs17577, rs17576, rs3918242 гена ММР-9, rs1799750 гена ММР-1, rs679620 гена ММР-3 с соответствующими олигонуклеотидными праймерами и зондами, синтезированными ООО «ТестГен» (Ульяновск).

Анализ SNP×SNP взаимодействий, определяющих подверженность к развитию ПОУГ у мужчин, проводился методом Монте-Карло марковских цепей и байесовской непараметрической статистики с использованием программного обеспечения АРSampler (http: //sources.redhat.com/cygwin). Для коррекции на множественные сравнения использовался пермутационный тест. Характер ассоциации, выявленных межгенных взаимодействий, оценивался с помощью показателя отношения шансов (OR) и его 95% доверительного интервала (95%CI) [27].

Функциональное значение исследуемых полиморфных локусов генов ММР изучалось с помощью программ HaploReg (v4.1) (http://archive.broadinstitute.org/mammals/ha ploreg/haploreg.php) (оценивались эпигенетические эффекты полиморфных локусов), GTExportal (http://www.gtexportal.org/) (изучалась связь полиморфизма генов с экспрессией генов (cis-eQTL)),  PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml) (выявлялась связь с аминокислотными заменами в кодируемом полипептиде и оценивался их предикторный потенциал).

Результаты и их обсуждение. Результаты популяционно-генетического анализа полученного нами распределения генотипов MMP в исследуемых выборках мужчин, больных ПОУГ и контрольной группы, представлены в таблице 1. Следует отметить, что по всем рассмотренным локусам генов MMP наблюдаемая гетерозиготность (H_o) соответствует теоретически ожидаемой гетерозиготности (H_e) (наблюдаемое распределение генотипов достоверно не отличается от ожидаемого распределения согласно равновесия Харди-Вайнберга) (>0,05).

С использованием биоинформатического подхода (программа АРSampler) определены комбинации генетических вариантов  полиморфных локусов генов ММР, вовлеченных в формирование ПОУГ у мужчин (табл. 2). Полученные нами данные свидетельствуют о статистических значимых ассоциациях 16 моделей SNP×SNP взаимодействий генов MMP разного уровня (4 двухлокусных, 7 трехлокусных и 5 четырехлокусных моделей) c развитием ПОУГ у мужчин (p_perm<0,05).  При этом, среди 16 статистически значимых моделей, связанных с формированием ПОУГ у мужчин, 6 моделей являются протективными и 10 моделей – факторы риска развития ПОУГ (OR=1,80-9,26).

Обращает на себя внимание факт того, что в состав моделей межгенных взаимодействий, определяющих подверженность к ПОУГ у мужчин, входят все 8 изучаемых нами полиморфных локусов генов матриксных металлопротеиназ: rs3918249, rs3787268, rs2250889, rs17577, rs17576, rs3918242 гена ММР-9, rs1799750 гена ММР-1, rs679620 гена ММР-3. Так же следует отметить, что в состав наибольшего количества моделей ген-генных взаимодействий, ассоциированных с формированием ПОУГ, входят полиморфные локусы rs1799750 ММР-1 (10 моделей) и rs2250889 ММР-9 (8 моделей).

Установлено, что SNP×SNP взаимодействие rs2250889 ММР-9 × rs17576 ММР-9 является основой 6 моделей, а rs3918249 ММР-9 × rs1799750 ММР-1 входит в состав 5 «значимых» моделей, связанных с формированием ПОУГ у мужчин.

На следующем этапе нашей работы были изучены эпигенетические эффекты наиболее ПОУГ-значимых полиморфных локусов генов матриксных металлопротеиназ (rs1799750 ММР-1 и rs2250889 ММР-9). С использованием программы HaploReg (v4.1) установлено, что rs1799750, расположенный в интроне гена ММР-1, имеет выраженный регуляторный потенциал: он находится в области регуляторных мотивов ДНК, взаимодействующих с регуляторными белками CFOS и GATA2,  регионе гиперчувствительности к ДНКазе-1 в пяти клеточных культурах и тканях (в том числе в  H1 Derived Mesenchymal Stem Cells, Fibroblast Primary Cells и др.), регионе модифицированных гистонов (H3K4me1, H3K9ac), маркирующих энхансеры в шести различных культурах клеток, тканях и органах, находится в области  сайтов связывания с 21 транскрипционным фактором (AP-1_disc8, CHX10, DMRT2, Dbx1, En-1_3, Ets_disc1, Evi-1_4, GATA_known1, HMG-IY_1, Hlx1, Hoxb4, Msx-1_2, Ncx_2, Nkx6-1_2, PLZF, Pax-4_2, Pax-6_3, Pou2f2_known4, Pou3f2_4, Pou3f4, Pou6f1_2). Наряду с этим, согласно данным, представленным в онлайн базе GTExportal, полиморфизм rs1799750 ассоциирован с уровнем экспрессии трех генов (MMP1, MMP10, WTAPP1) в различных органах и тканях  (p_FDR≤0,05) (табл. 3).

Согласно нашим данным регуляторные эффекты полиморфного локуса rs2250889 гена ММР-9 также значимы: в соответствии с базой данных HaploReg (v4.1) он находится в эволюционно консервативном регионе ДНК, локализован в регионе модифицированных гистонов маркирующих промоторы (H3K4me3, H3K27ac) и энхансеры (H3K4me1, H3K9ac) в множестве различных культур клеток, тканях и органах (H1, H9 Derived Neuronal Progenitor Cultured Cells,         H9 Derived Neuron Cultured Cells, hESC Derived CD56+ Ectoderm Cultured Cells, hESC Derived CD184+ Endoderm Cultured Cells, hESC Derived CD56+ Mesoderm Cultured Cells, H1 Derived Mesenchymal Stem Cells и др.), находится в области регуляторного мотива ДНК, взаимодействующего с регуляторным белком CTCF и расположен в  регионе  сайтов связывания с 2 транскрипционными факторами (NRSF_disc3 и NRSF_known2). Материалы, представленные в онлайн базе данных GTExportal, свидетельствуют о важном eQTL и sQTL значении полиморфизма rs2250889. Данный полиморфный локус ассоциирован с уровнем транскрипции гена PLTP в слизистой оболочке пищевода (β=0,49, р=7,5e-13, p_FDR≤0,05), коже (β=0,42-0,45, р=6,2e-11 – 6,8e-10, p_FDR≤0,05), гена PCIF1 в крови (β=-0,12, р=0,000065, p_FDR≤0,05),          гена NEURL2 в большеберцовом нерве (β=0,35, р=0,00012, p_FDR≤0,05), а также с связан с уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта гена SLC12A5 в гипофизе (интрон ID:46021886:46023369:clu_29529, β=1,10, p=4,7e-9, p_FDR≤0,05). Наряду с этим полиморфизм rs2250889, расположенный в 10 экзоне гена MMP-9, определяет несинонимическую замену нуклеотида G на C в 1721 положении (c.1721G>C), что приводит к замене аминокислоты аргинин на аминокислоту пролин в 574 положении полипептида MMP-9 (p.Arg574Pro) (http://www.ensembl.org/). Эта миссенс мутация, согласно базы данных PolyPhen-2,  имеет предикторный класс «BENIGN» (score=0, чувствительность 1,00, специфичность – 0,00).

Таким образом, полиморфные локусы rs1799750 ММР-1  и rs2250889 ММР-9, играющие наиболее существенную роль в формировании подверженности к ПОУГ у мужчин (входят в состав наибольшего количества моделей SNP×SNP взаимодействий, ассоциированных с развитием заболевания), имеют важное функциональное значение в организме (эпигенетические эффекты, eQTL, sQTL, несинонимическая замена). Полиморфизм rs1799750 ММР-1 находится в области регуляторных мотивов ДНК, взаимодействующих с регуляторными белками CFOS и GATA2, регионе гиперчувствительности к ДНКазе-1 в пяти клеточных культурах и тканях, регионе модифицированных гистонов, маркирующих энхансеры в шести различных культурах клеток, тканях и органах, находится в области  сайтов связывания с 21 транскрипционным фактором,  ассоциирован  с уровнем экспрессии трех генов (MMP1, MMP10, WTAPP1).  Полиморфный локус rs2250889 определяет несинонимическую замену в гене MMP-9 (p.Arg574Pro), локализован в эволюционно консервативном регионе ДНК, расположен в регионе модифицированных гистонов маркирующих промоторы  и  энхансеры  в множестве различных культур  клеток, тканях и органах, находится в области регуляторного мотива ДНК, взаимодействующего с регуляторным белком CTCF, расположен в  регионе  сайтов связывания с 2 транскрипционными факторами (NRSF_disc3 и NRSF_known2), ассоциирован с уровнем транскрипции 3 генов (PLTP,  PCIF1,  NEURL2) и уровнем альтернативного сплайсинга транскрипта гена SLC12A5.

Согласно литературным данным, матриксные металлопротеиназы представляют собой обширное семейство внеклеточных, цинк-содержащих протеиназ, отвечающих за рзрушение  компонентов внеклеточного вещества как при физиологических, а также при патологических состояниях [28, 29, 30]. регулируемые на разных уровнях, включая транскрипцию, активацию белка и взаимодействие с эндогенными ингибиторами.  MMP имеют большое значение в обмене белков соединительной ткани, в процессах развития межклеточного вещества в норме, а также при онкогенном перерождении клеток, ремоделировании внеклеточного матрикса в процессе развития и роста различных тканей, включая ткани глаз [31].  Матриксная металлопротеиназы-1 (MMP-1), также известная как интестинальная коллагеназа и коллагеназа I, синтезируется фибробластами, хондроцитами, макрофагами, кератиноцитами, эндотелиальными клетками и остеобластами [32].

Матриксная металлопротеиназа-9 (MMP-9 или желатиназа B) играет важную роль в процессах воспаления, ремоделирования ткани, репарации, регуляции связанных факторов роста и обмена цитокинов. Активность MMP-9  регулируется TIMP-3 и различными цитокинами и факторами роста, включая интерлейкины, интерфероны, эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста нервов (NGF), основной фактор роста фибробластов (FGFb), фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор некроза опухоли α (TNF-α), трансформирующий фактор роста β (TGF-β) и остеопонтин [18, 19]. MMP-9 отвечает за лизис белков внеклеточного межуточного вещества, а также активация  различных факторов роста, таких как pro-TGF-β и pro-TNF-α [30].

В ряде ранее проведенных исследований установлено, что ММР-1 и MMP-9 были вовлечены в снижении устойчивости к оттоку внутриглазной жидкости глаза, особенно содержание ММР-9 было связано с процессом глаукомы. По сравнению со здоровыми глазами в глаукоматозных глазах концентрация ММР- 9 была достоверно выше. Эти изменения были обнаружены в водянистой влаге, радужно-роговичный углу и теноновой капсуле у пациентов с различными видами глауком, в том числе, ПОУГ [13]. Роль матриксных металлопротеиназ в регуляции оттока ВГЖ исследовалась Rönkkö S.et al. (2007). Была изучена экспрессия ММР и тканевых ингибиторов (MMP-1, -2, -3, -9, TIMP-1, -2, -3) у больных ПОУГ и эксфолиативной глаукомой (ЭГ). Концентрация ММР-1 в образцах с ПОУГ значительно превышало этот показатель при эксфолиативной глаукоме [33].

Авторы Manabe S et al. (2005) сообщают о том, что аномальная активация ММP-9 при помощи оксида азота NO вызывает внеклеточный сигнальный каскад, ведущий к апоптозу. У мышей с удаленным геном ММР-9, в той же степени, как и у животных, у которых ММР-9 фармакологически был ингибирован, ретинальные клетки не погибают от апоптоза [34].

При изучении ассоциации полиморфизмов ММР-9 с глаукомой в популяции Южного Китая установлено, что полиморфизм rs2250889 является фактором риска для развития первичной закрытоугольной глаукомы (ПЗУГ) (OR = 1,76, р = 0,004) [35], что полностью согласуется с полученными нами результатами о значимой роли данного полиморфизма в формировании ПОУГ у мужского населения России. В результате исследования, проведенного Micheal S. et al у 112 пациентов с ПОУГ, 82 пациентов с ПЗУГ и 118 здоровых людей в популяции Пакистана, выявлено, что фактором риска развития ПОУГ у женщин является полиморфизм ММР-1 rs1799750 (-1607 1G / 2G) (р<0,001), в то время как этот полиморфизм у лиц мужского пола не ассоциирован с ПОУГ (р> 0,47) [25]. Mossböck G et al.  исследовали  полиморфизм MMP-1-1 rs1799750 у пациентов с ПОУГ. В исследование были включены 322 пациента с ПОУГ, 202 пациентов с эксфолиативной глаукомой и 248 здоровых индивидуумов. Никаких существенных различий в распределении данного полиморфизма не было установлено между пациентами с ПОУГ и контрольной группой [36]. Следует отметить, что в нашем исследовании, показана значимая роль полиморфизма rs1799750 ММР-1 в формировании ПОУГ у мужчин.

Заключение. Межгенные взаимодействия полиморфных локусов генов ММР ассоциированы с формированием первичной открытоугольной глаукомы у мужчин. 16 моделей SNP×SNP взаимодействий генов MMP (4 двухлокусных, 7 трехлокусных и 5 четырехлокусных) определяют подверженность к развитию заболевания, из которых 10 моделей, ассоциированы с   повышенным риском, а 6 моделей имеют протективную направленность. В состав наибольшего количества моделей ген-генных взаимодействий, связанных с развитием ПОУГ, входят полиморфные локусы rs1799750 ММР-1 (10 моделей) и rs2250889 ММР-9 (8 моделей). Данные полиморфные локусы (rs1799750 и rs2250889) имеют важное функциональное значение в организме (эпигенетические эффекты, eQTL, sQTL, несинонимическая замена).

В отношении данной статьи не было зарегистрировано конфликта интересов.