Иматиниба мезилат – ингибитор протеинтирозинкиназы (рис. 1). В основе клинической эффективности иматиниба лежит ингибирование BCR-ABL-киназы. На первых этапах доклинических и клинических исследований была доказана эффективность фармацевтической субстанции, а впоследствии и референтного препарата, для лечения Ph-позитивного хронического миелоидного лейкоза в любой фазе. Впоследствии препарат был одобрен для лечения больных с KIT (CD117)-позитивными неоперабельными и/или метастатическими стромальными опухолями желудочно-кишечного тракта [3, 4]. В настоящее время FDA одобрило новое показание к применению препарата Гливек – для лечения детей с впервые выявленным острым лимфобластным лейкозом с положительной филадельфийской хромосомой (Ph +) [6]. В связи с клинической значимостью рассматриваемого препарата, разработка и вывод на фармацевтический рынок воспроизведенных лекарственных препаратов, содержащих иматиниб, является актуальным.

Рис. 1. Иматиниб

Fig. 1. Imatinib

В связи с ФЗ «Об обращении лекарственных средств», одним из разделов регистрационного досье, подаваемого для регистрации воспроизведенного лекарственного препарата, должен быть отчет о проведении исследований его биоэквивалентности [2]. В настоящее время метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) является эталонным для качественной и количественной оценки аналита в плазме при проведении данного исследования.

В связи с изложенным целью работы явилась разработка и валидация методики количественного определения иматиниба методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием.

Экспериментальная часть.

В работе использовали следующие реактивы: иматиниб, дазатиниб (ф. Sigma), ацетат аммония (ф. Merk), метанол (ф. Merk), ацетонитрил для градиентной хроматографии (ф. Merk), вода очищенная и деионизированная с помощью системы «Gene Pure» (Thermo Scientific, США).

Определение иматиниба в биологической жидкости (плазма крови человека) проводили на жидкостном хроматографе UltiMate 3000 RS LC (Thermo Fisher Scientific, США), оснащенным вакуумным дегазатором, градиентным насосом, автосемплером, термостатом колонок. Детекцию аналита проводили на масс-спектромтере Velos Pro (Thermo Scientific, США) с ионизацией в нагреваемом электроспрее (H-ESI-II).

Пробоподготовка.

С применением стандартных образцов дазатиниба и иматиниба (ф. Sigma) были приготовлены их исходные растворы в 20% растворе ацетонирила в 0,1% муравьиной кислоте в концентрациях 0,0016% и 0,04%, соответственно. Путем серийного разведения исходного раствора иматиниба были получены его рабочие растворы для построения калибровочной кривой (в концентрациях от 0,03 мкг/мл до 3,83 мкг/мл в плазме) и образцов контроля качества (0,1 мкг/мл; 1,8 мкг/мл и 3 мкг/мл в плазме).

Для приготовления указанных растворов к 600 мкл плазмы прибавляли по 50 мкл 1% водного  раствора муравьиной кислоты, 50 мкл раствора внутреннего стандарта, 50 мкл соответствующего исходного раствора иматиниба и 700 мкл ацетонитрила. Для приготовления бланка к плазме вводили 50 мкл 1% водного раствора муравьиной кислоты и 700 мкл ацетонитрила.

ВЭЖХ-МС/МС.

Хроматографическое разделение осуществляли на колонке размером 50×2,1 мм, заполненной обращённо-фазовым сорбентом С18 с размером частиц 1,7 мкм (ACQUITY UPLC BEH C18) при температуре 45˚С. Хроматографический анализ проводили с использованием системы UltiMate 3000 RS LC сопряженной с масс-спектрометрическим детектором в изократическом режиме при следующих хроматографических условиях:

Исследуемые аналиты в плазме детектировали с применением масс-спектрометрического детектора Velos Pro – двухкамерная линейная квадрупольная ионная ловушка низкого и высокого давления  с ионизацией в нагреваемом электроспрее (H-ESI-II) с технологией двойной десольвационной зоной. Сканирование осуществляли по селективно выбранным ионам (SIM). Параметры работы детектора представлены ниже:

Результаты и обсуждение:

Применение  в   методике  колонки  ACQUITY  UPLC BEH  размером 50 × 2,1 мм, заполненной обращённо-фазовым сорбентом С18 с размером частиц 1,7 мкм позволило получить удовлетворительную форму пиков иматиниба и дазатиниба. Хроматографическая система считалась пригодной при выполнение следующих критериев: относительное стандартное отклонение отношения площадей определяемых пиков к пику внутреннего стандарта, рассчитанное по шести последовательным хроматограммам раствора одной концентрации – не более 7 %; фактор асимметрии пиков иматиниба и дазатиниба – не более 2,2; эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику иматиниба– не менее 1000 теоретических тарелок; соотношение сигнал/шум для раствора на уровне нижнего предела количественного определения (НПКО) не менее 10:1. Хроматограммы дазатиниба (внутренний стандарт) и иматиниба с концентрацией в плазме на уровне НПКО (0,03 мкг/мл в плазме) представлены на рис. 2.

Рис. 2 - Хроматограммы и масс-спектры иматиниба (рис. 2а и 2в) и дазатиниба (рис. 2б и 2г) в плазме

Fig. 2 - Chromatography and mass spectra of imatinib (Fig. 2a and 2b) and dasatinib (Fig. 2b and 2d) in plasma

Валидацию аналитического метода проводили в соответствии с отечественными и зарубежными требованиями, предъявляемыми к биоаналитическим методикам по следующим показателям:  селективность, матричный эффект, линейность, нижний предел количественного определения, линейность, специфичность, прецизионность, воспроизводимость [1, 4].

Для того, чтобы избежать нарушения линейности градуировочной зависимости, связанной с влиянием компонентов биологической матрицы на ионизацию в масс-спектрометрии одним из важных этапов при разработке и валидации методик в плазме крови, является изучение матричного эффекта. Указанный показатель исследовали на шести образцах биологической матрицы различных доноров. Значения коэффициента вариации (CV) нормализованных матричных факторов для шести различных матриц на  нижнем и верхних уровнях концентраций не превышало 15% и, составили 12,8% и 5,1%, соответственно.

Для построения градуировочной кривой (рис. 3) использовали рабочие растворы на семи уровнях концентраций в трех повторностях, бланк (чистая матрица) и бланк с внутренним стандартом (матрица без введения аналита, но с добавлением внутреннего стандарта).

Рис. 3 – Линейность методики определения иматиниба в диапазоне концентраций от 0,03 до 3.8 мкг/мл

Fig. 3 - Linearity methods for determining imatinib concentrations ranging from 0.03 to 3.8 mcg / ml

         Извлеченные стандарты иматиниба из плазмы позволили получить линейную калибровочную кривую в динамическом диапазоне от 0,03 до    3,83 мкг в 1 мл биологического объекта с коэффициентом R² равным 0,9997. Ни одна из ошибок не превышала допустимых пределов – не более 20% для раствора НПКО, и не более 15% - для остальных концентраций.

         Правильность методики оценивали на образцах биологической матрицы с добавлением известных количеств аналита на уровнях концентраций: НПКО, нижний контроль качества (НКК), средний контроль качества (СКК) и верхний контроль качества (ВКК), которые получали независимо от растворов, приготовленных для подтверждения линейности методики. Правильность выражали в процентах от номинального значения иматиниба. Результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1

Правильностьопределенияиматинибавплазме

Table 1

The correctness of the definition of imatinib plasma

         Для проведения теста прецизионность проводили шесть повторных измерений концентрации (НПКО, НКК, СКК, ВКК) иматиниба в одном и том же образце по вышеописанной методике в четырех разных цикла. Все результаты были близки между собой (табл. 2).  

Таблица 2

 Прецизионность методики определения иматиниба в плазме

Тable 2

  Precision of methods for determining imatinib in plasma

         Таким образом, разработанная методика количественного определения иматиниба в плазме крови человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием проста в исполнении, соответствует требованиям валидационных характеристик и достоверно позволяет определять иматиниб в плазме крови в концентрациях от 0,03 мкг/мл до 3,83 мкг/мл.