Введение. Условия количественного определения β-циклодекстрана методом ВЭЖХ описаны в монографии “Betadex” Европейской фармакопеи, а также в фармакопеи США и в многочисленных информационно-рекламных материалах фирм, производящих хроматографические колонки. Наиболее полная информация о режимах хроматографирования представлена фирмой “Showa Denko K.K.”., Япония. При количественном определении по методике Европейской фармакопеи применяют колонку, заполненную сорбентом с октадецильными группами, по методике фармакопеи США анализ проводят на колонке с аминными группами. Условия хроматографирования, приведенные в рекламных материалах фирмы “Showa Denko K.K.”, предполагают использование эксклюзионных колонок с рабочим диапазоном, начиная с 3000 дальтон [1, 2].

Поскольку в составе препарата присутствуют различные неорганические ионы и высокомолекулярное соединение – ПВП, применять колонку с аминными группами нельзя ввиду происходящих между сорбентом и компонентами пробы необратимых реакций. Применить эксклюзионный режим хроматогафирования возможно, но при этом на сорбенте, который обеспечивает необходимое разделение ближайших к β-циклодекстрану веществ (ά- и γ-циклодекстранов) получается размытый пик ПВП, который при регистрации на рефрактометрическом детекторе частично, перекрывается с пиком β-циклодекстрана, что существенно ухудшает метрологические характеристики методики. Хроматографирование в условиях монографии “Betadex” Европейской фармакопеи позволяет получить полное разделение хроматографических зон β-циклодекстрана от других компонентов препарата, но при этом время ПВП выхода превышает 120 мин, при том, что время выхода β-циклодекстрана находится в пределах от 5 до 7 мин. Значительное время удерживания ПВП приводит к сильному расширению его хроматографической зоны, при этом чувствительность используемого для регистрации β-циклодекстрана рефрактометрического детектора уже не позволяет получать достоверные результаты количественного содержания ПВП в препарате. А в случае не полного элюирования хроматографической зоны ПВП уже наблюдается невоспроизводимость времен удерживания и площадей пиков β-циклодекстрана из-за модификации сорбента ПВП [3].

Установить время полного элюирования пика ПВП можно проводя одновременно детектирование рефрактометрическим и УФ-ВИД спектрофотометрическим детектором. Использование УФ-ВИД спектрофотометрического детектора позволяет существенно увеличить чувствительность регистрации ПВП, поскольку в УФ спектре этого соединения имеется коротковолновый участок, в котором наблюдается достаточно интенсивное поглощение.

Цель исследования: разработка и валидация методики совместного определение β-циклодекстрана и поливинилпирролидона в многокомпонентных препаратах методом ВЭЖХ.

Задачи исследования:

1. Подбор оптимальных колонки и сорбента для проведения количественного определения ПВП отдельно от β-циклодекстрана методом эксклюзионной хроматографии

2. Валидация методики по показателям правильность, сходимость (прецизионность), линейность, диапазон применения.

Материалы и методы исследования. При разработке данной методики и проведение валидационных исследований использовали блочный жидкостный хроматограф модели LC-20 (Shimadzu Co. Япония) в следующей комплектации:

- два насоса высокого давления модели LC 20 ADvp;

- автоинжектор SIL-20A

- термостат колонок CTO-20A в термостат, в которого вмонтирован 6 ти портовой кран высокого давления FCV-12AH₂

- рефрактометрический детектор RID-10A;

- спектрофотометрический детектор SPD-20A.

Испытуемый раствор препарата готовят путем его разбавления в воде или подвижной фазе, чтобы получить концентрацию β-циклодекстрана и ПВС на уровне около 10 мг/мл и 3 мг/мл соответственно.

Отдельно готовят раствор сравнения β-циклодекстрана и раствор сравнения ПВП с теми же концентрациями.

По 20 мкл испытуемого раствора и раствора сравнения β-циклодекстрана и раствора сравнения ПВП хроматографируют.

Условия хроматографирования:

- основная колонка – размером 250 мм х 0,46 мм, заполненная сорбентом Equisil ODS, размер частиц 5 мкм, (производство Dr. Maisch, Германия);

- защитная колонка – размером 20 мм х 4,0 мм Discovery HS C18, размер частиц 5 мкм (Supelco, США);

- подвижная фаза: вода – метанол (90 : 10);

- скорость подачи подвижной фазы через основную колонку – 1 мл/мин;

- скорость подачи подвижной фазы через защитную колонку – 2 мл/мин;

- длина волны детектирования УФ-ВИД детектором – 226 нм;

- температура термостата колонок –  30 ^оС;

Концентрацию β-циклодекстрана или ПВС в испытуемом растворе (С_i) определяют по формуле:

где: S_i – среднее значение площадей пиков β-циклодекстрана или ПВП, рассчитанное из хроматограмм испытуемого раствора;

S_oi – среднее значение площадей пиков β-циклодекстрана или ПВП, рассчитанное из хроматограмм раствора сравнения β-циклодекстрана или раствора сравнения ПВП;

C_oi – концентрация β-циклодекстрана или ПВП в соответствующем растворе сравнения, в миллиграммах в 1 мл.

Для устранения негативного влияния ПВП на результаты анализа автором была предложено проводить хроматографирование проб содержащих β-циклодекстран и ПВП с использованием двух колонок подключенных к 6-ти портовому крану, расположенному в термостате колонок [4]. Одна из колонок выполняет защитную функцию и предотвращает попадание ПВП во вторую, а вторая колонка служит для отделения β-циклодекстрана от других компонентов препарата. Схема подключения колонок показана на рис. 1:

Рис. 1. Схема подключения колонок к 6-портовому крану

Fig. 1. The scheme of connecting the columns to the 6-port tap

Как видно из рис.1, принцип работы этой схемы заключается в том, что в момент введения 6-ти портовый кран находится в положении показанном сплошными линиями на рис. 1 и все компоненты пробы попадают в защитную колонку К1, в которой происходит разделение ПВП от остальных веществ, включая и β-циклодекстран. Скорость продвижения хроматографической зоны ПВП по колонке 1 составляет около 1 мм/мин и за время нахождения 6-ти портового крана в этом положении (1.5 мин) успевает пройти около 1.5 мм. После переключения 6-ти портового крана поток подвижной фазы направляется в основную колонку К2 уже минуя защитную колонку, а в защитную колонку отдельным насосом подается подвижная фаза в противоположном направлении. Хроматографическая зона ПВП из защитной колонки элюируется и попадает в УФ-ВИД спектрофотометрический детектор, где и происходит ее регистрация. При прохождении подвижной фазы по колонке в обратном направлении происходит фокусировка хроматографической зоны ПВП, за счет чего пик ПВП получается достаточно симметричным.

В основной колонке происходит разделение пиков β-циклодекстрана от остальных компонентов препарата и хроматографическая зона β-циклодекстрана регистрируется рефрактометрическим детектором. Таким образом при одном введении пробы испытуемого раствора происходит определение и β-циклодекстрана, и ПВП. Время хроматографирования составляет около 10 мин.

Результаты и их обсуждение. Методики с переключением потоков подвижной фазы и предварительным отделением от других компонентов препарата и концентрированием определяемых веществ в непосредственно ходе проведения анализа мало распространенны в практике фармацевтического анализа [6, 7].

Разработанная методика идентификации и количественного определения β-циклодекстрана и ПВП была исследована по показателям: «специфичность», правильность; прецизионность (сходимость), линейность, диапазон применения. Исследования проводили на модельных образцах, полученных в лабораторных условиях с использованием двух вариантов раствора «плацебо» препарата. В первом случае – без β-циклодекстрана, а во втором – без ПВП. Соответствие методики требованиям по показателю специфичность подтверждается следующими данными:

1. На хроматограмме раствора плацебо и хроматограмме растворителя отсутствуют пики со временем удерживания, совпадающим со временем удерживания пиков бетадекса на хроматограмме испытуемого раствора. То есть, все остальные компоненты препарата и растворитель не мешают проведению испытаниям на подлинность и количественному определению β-цикло­декстрана.

2. На хроматограмме раствора для проверки пригодности хроматографической системы наблюдается полное разделение пиков бетадекса и пиков его ближайших аналогов – α-циклодекстрана и γ-цикло­декстрана.

3. Доверительные интервалы времен удерживания пиков β-циклодекстрана на хроматограммах испытуемого раствора и доверительные интервалы времён удерживания пиков β-циклодекстрана на хроматограммах суммарного раствора сравнения перекрываются, т.е. не имеют статистически значимой ошибки. Значения времен удерживания пиков β-циклодекстрана представлены в таблице 1.

Значения времен удерживания пиков β-циклодекстрана на хроматограммах испытуемого раствора препарата и раствора сравнения β-циклодекстрана

Table 1

The retention times of β-cyclodextran peaks on the chromatograms of the test solution
and the β-cyclodextran comparison solution

Требование к перекрыванию доверительных интервалов значений времен удерживания пиков определяемых веществ на хроматограммах испытуемого раствора и раствора сравнения представляется более правильным, чем обычно указываемое в НД требование о 2 % совпадении времен удерживания. Поскольку возможен случай, когда доверительные интервалы могут не перекрываться, при этом попадать в 2 %
диапазон.

Проведение идентификации по совпадению времен удерживания по разработанной методике для ПВП не корректно, поскольку роль защитной хроматографической колонки сводится только к отделению хроматографической зоны ПВП от других компонентов препарата, и время удерживания зависит от времени переключения 6-ти портового крана.

Данные о других метрологических характеристик методики были получены путем хроматографирования модельных растворов с концентрацией ПВП и β-циклодекстрана от 80 % до 120 % от номинального значения. Результаты хроматографирования модельных растворов и расчет метрологических характеристик методики при определении β-циклодекстрана и ПВП представлены в таблицах 2 и 3.

Результаты анализа модельных смесей препарата, содержащих от 80% до 120 %
по отношению к номинальной концентрации β-циклодекстрана,
и их статистическая обработка

Table 2

The results of the analysis of model mixtures of the preparation containing from 80% to 120% with respect to the nominal concentration of β-cyclodextran and their statistical treatment

Из данных, приведенных в табл. 2, следует, что методика количественного определения β-циклодекстрана и ПВП характеризуется достаточной правильностью и сходимостью (прецизионностью) во всем диапазоне концентраций, является корректной и не имеет практически значимой систематической ошибки.

Характеристику «Линейность» исследовали в диапазоне концентраций бетадекса от 80 % до 120 % по отношению к номинальному значению.

Графики линейной зависимости найденного количества бетадекса от введенного для представлен на рис.2, а результаты расчета параметров линейной зависимости – в таблице 3.

Рис. 2. График линейной зависимости найденного количества β-циклодекстрана от введенного

Fig. 2. The graph of the linear dependence of the found amount of β-cyclodextran on the introduced amount

Таблица 3

Метрологические характеристики линейной зависимости найденной концентрации
β-циклодекстрана от его введенной концентрации

Table 3

Metrological characteristics of the linear dependence of the found concentration
of β-cyclodextran on its administered concentration