Главная
16+
Научные результаты биомедицинских исследований → 2019 → Том 5, Выпуск №3, 2019
DOI: 10.18413/2658-6533-2019-5-3-0-4

Поиск сайтов связывания микро РНК в цис-регуляторных последовательностях и в SNP в генах липидного, углеводного обмена, окислительного и противовоспалительного гомеостаза

Ольга Михайловна Нескубина
Светлана Сергеевна Амелина
Татьяна Павловна Шкурат
Дмитрий Евгеньевич Романов

Aннотация

Актуальность: Полиморфизмы и нарушение профиля экспрессии генов miRNA связывают с системными заболеваниями (аутоиммунные и сердечно-сосудистые заболевания). Цель исследования:Изучение локализации сайтов связывания miRNA с mRNA в цис-регуляторных районах генов и в кодирующих последовательностях ДНК (CDS) ассоциированных в наших исследованиях с ранним и поздним атеросклерозом, а также поиск возможных локализаций сайтов связывания с микроРНК с участками генов (PPARGC1A; LIPC; PON1; APOE; LPL;APOC3; EDN; TNFα;SERPINE1). Материалы и методы:Поиск мотивов гомологичных микро РНК осуществлялся в цис-регуляторных районах изучаемых генов с помощью биоинформационного пакета MEME Suite. Известные miRNA мы взяли из электронной базы данных под названием  «miRBase» (адрес сайта http://mirbase.org/). Из базы данных NCBI нами были получены нуклеотидные последовательности цис-регуляторных районов и интронов генов (адрес сайта http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) при помощи сочетания скриптов, IFITCH, созданных для автоматизированного получения информации от последовательностей NCBI. Ранее упомянутая нами электронная база данных «miRBase» анализировали автоматически при помощи поиска сайтов связывания в исходной последовательности, при этом мы использовали программу «MScanner». Было зарегистрировано 28645 микроРНК (http://www.mirbase.org). Результаты:Результаты биоинформационного поиска локализации мотивов гомологичных известным микроРНК перед и после гена, а также в кодирующих белок-последовательностях и интронов следующих генов: PON1, APOC3, LIPC, LPL, APOE, PPARGC1A, TNF, EDN, SERPIN показал, что в генах и межгенных пространствах находится большое количество мотивов, гомологичных зрелым микро-РНК. Наибольшее абсолютное количество мотивов локализовано внутри гена PPARGC1A  –  22 микроРНК. Однако, если рассматривать относительную частоту локализации микроРНК расчитанную на 100000 п.н., то наибольшее число микроРНК локализовано в гене PON1 и составляет 7.6х10-5. В то время как для гена PPARGС1эта частота составляет 3.2х10-5. Заключение: Таким образом, обнаруженные нами микроРНК локализованные в большом количестве внутри и около изучаемых генов, могут указывать на их функциональную роль в патогенезе атеросклероза.



Ключевые слова: микроРНК, цис-регуляторные последовательности, ранний и поздний атеросклероз, гены: PON1, APOC3, LIPC, LPL, APOE, PPARGC1A, TNF, EDN, SERPIN, сайты связывания

Введение. Полиморфизмы и нарушение профиля экспрессии генов miRNA, в последние годы связывают с различными системными заболеваниями, такими как рак, аутоиммунные и сердечно-сосудистые заболевания. Ранее было показано, что сайты взаимодействия miRNA с mRNA гена расположены на всех участках гена: 3’-нетранслируемом участке (3’UTR), 5'-нетранслируемом участке (5'UTR), белок-кодирующей нуклеотидной последовательности (CDS) [1, 2]. Большинство исследований посвящено изучению взаимодействии miRNA c 3’UTR mRNA.  В последние годы показано, что многие miRNA кодируются в межгенных участках ДНК и обнаружены в интронах [3, 4]. Интронные miRNA (in-miRNA) локализованы в интронах белок-кодирующих генов и транскрибируются с ДНК автономно от транскрипции pre-mRNA при наличии собственного промотора, либо вырезаются из pre-mRNA в виде pre-miRNA [5].

За несколько последних десятилетий были получены открытия, коткорые показывают, что РНК может  работать не только в качестве функционального  посланника, связывающего ДНК и белок, но также может участвовать в регулировании и может организовывать геном, также может регулировать экспрессии генов, а роль РНК непосредственно увеличивается с усложнением (увеличением сложности)  организма [6, 7]. Продемонстрирована важность РНК в эпигенетических процессах, контролирующих дифференциацию и развитие. Все эти научные открытия говорят о том, что РНК может  играть главную роль  в эволюции и онтогенезе человека [8, 9, 10].  Видимо, что и микроРНК играет весомую регуляторную роль в процессе формирования атеросклероза.

Целью данной работы было изучение локализации сайтов связывания miRNA с mRNA в цис-регуляторных  районах генов и в кодирующих последовательностях ДНК (CDS)  ассоциированных в наших исследованиях с ранним и поздним атеросклерозом, а также поиск возможных локализаций сайтов связывания с микроРНК с участками генов, в котором локализованы изучаемые полиморфизмы. 

Материалы и методы. Нуклеотидные последовательности цис-регуляторных районов, CDS последовательностей и интронов генов  мы получили из электронной базы данных под названием «NCBI» (адрес сайта http:///www.ncbi.nlm.nih.gov/). Известные микроРНК выгружали из базы данных «miRBase» (http://mirbase.org/),  в которой на момент проведения исследования было зарегистрировано 28645 микроРНК человека, далее проводили поиск сайтов связывания с помощью автоматизированной программы «MScanner» [11, 12].

Результаты исследования и их обсуждение. Проведенный нами анализ биоинформации показывает, что в генах и в межгенных пространствах может находиться дстаточно большое количество мотивов, гомологичных зрелым микро-РНК. В таблице 1 представлены результаты биоинформационного поиска локализации мотивов гомологичных известным микроРНК перед и после гена, а также в кодирующих белок-последовательностях и интронов следующих генов: PON1, APOC3, LIPC, LPL, APOE, PPARGC1A, TNF, EDN, SERPIN.

Как видно из представленных результатов наибольшее абсолютное количество мотивов локализовано внутри гена PPARGC1A  –  22 микроРНК. Однако, если рассматривать относительную частоту локализации микроРНК расчитанную на 100000 п.н., то наибольшее число микроРНК локализовано в гене PON1 и составляет 7.6х10-5  . В то время как для гена PPARGС1 эта частота составляет 3.2х10-5 . Относительная частота распределения мотивов микоРНК в зависимости от длины гена и изучаемого межгенного участка представлено на рисунке  1.

 

Как видно из представленных результатов, в межгенном пространстве частота локализации микроРНК значительно выше, чем внутри кодирующего участка гена и интронов.

Таким образом, обнаруженные нами микроРНК локализованные в большом количестве внутри и около изучаемых  генов, могут указывать на их функциональную роль в патогенезе атеросклероза.

Анализ сайтов связывания различных типов зрелых микроРНК в межгенном пространстве и внутри исследуемых генов представлен в таблице 2

Как видно из таблицы, наиболее часто встречались мотивы, гомологичные, hsa -mir-619 (135 копий), hsa-mir-5096 (91 копия), hsa-mir-1273 (30 копий) hsa-mir 5585 (26 копий), has-mir-548  (13 копий), mir-1285 (12 копии), hsa-mir-5095 (10 копии), hsa-mir-1303 (6 копий). Большинство последовательностей встречалось в двух копиях: hsa-mir-3674 (2 копии), hsa-mir-297 (2 копии), hsa-mir-3622 (2 копии), hsa-mir-1972 (2копии), hsa-mir-4687 (2 копии), hsa-mir-4277 (2 копии), hsa-mir-3116 (2копии), hsa-mir-6867 (2копии), hsa-mir-8062 (2копии).

Ранее было показано, что сайты связывания miR-5096 локализуются на 832 таргетных матричных РНК [13]. Возможно, такое достаточно большое количество сайтов связывания говорит нам о функциональной роли miR-5096 в качестве координатора экспрессии больших генных ансамблей. Ранее было обнаружено высокое копировальное качество генов hsa -mir-619 и  hsa-mir-5096 , обнаружили это при проведении анализа распространения микро РНК по кругу от оси генов соматоропина (GH1, GHRH, SST, и  IGF1) [14].  

При гипертонии была обнаружена циркулирующая микроРНК hsa-circ-0005870 ,  которая при построении авторами генных сетей по KEGG-пути включила микроРНК  hsa-miR-6807-3p, hsa-miR-5095, hsa-miR-1273g-3p, hsa-miR-5096, hsa-miR-619 -5р и их соответствующие мРНК [15, 16].

Определение miR-126, miR-155, miR-221, miR-222 в группах больных с гипертонической болезнью и ишемической болезнью сердца подтверждает корреляцию изучаемых микроРНК с исследуемыми заболеваниями сердечно-сосудистой системы [17].

Особый интерес представляют микроРНК сайты связывания, которых, были представлены в единичных случаях это: miR-8096, miR-3116-2, miR-4277, miR-566, miR-5009, miR-8069-2, miR-3133, miR-7113, miR-1304, miR-5708, miR-4496, miR-649, miR-6847, miR-1304, miR-3834, miR-4687, miR-3674. Возможно, эти микроРНК принимают важное участие в экспрессии генов, рядом с которыми они локализованы на разных этапах онтогенеза, в разных тканях. Очевидно, не все они будут связаны с развитием атеросклероза, но они представляют большой потенциал для изучения.

Цис-регуляторные районы генов, вовлеченных в процессы развития атеросклероза содержат таргетные мишени генов микро РНК mir-548   hsa -mir-619, hsa-mir-1273, hsa-mir-5096, has- mir-548, hsa-mir 5585, has-mir-5069.

Полиморфный локус гена PON1(Gln192Arg) расположен рядом с микро-РНК hsa-mir-6867 и hsa-mir-4277.  Полиморфный локус гена PPARGC1A Gly482Ser расположен рядом с микро-РНК hsa-mir-297. Внутри гена PPARGC1A нами была обнаружена локализация   сайта связывания с miR-297. С другой стороны, показано, что микроРНК управляет непосредственно эндотелиальной клеткой, а также клетками гладких мышц кровеносных сосудов и функциями макрофага, и таким образом регулирует прогрессию атеросклероза, в частности miR-297 изменяет  экспрессию гена  эндотелиального фактора роста сосудов VEGFA [18, 19], который, в свою очередь, ассоциирован с атеросклерозом  (OMIM: 192240) [20].  

Заключение. Таким образом, описанные нами новые микроРНК могут реально быть вовлечены в патогенез атеросклероза. Перспективы дальнейших исследований в этой области связаны с разработкой диагностических методов, развитием новых подходов лечения этих заболеваний на основе miRNA, предсказыванием и прогнозированием эффективности терапии.

В отношении данной статьи не было зарегистрировано конфликта интересов.

Список литературы

  1. Wu N., Jin L., Cai J. Profiling and bioinformatics analyses reveal differential circular RNA expression in hypertensive patients // Clinical and Experimental Hypertension.2017. Vol. 39(5). P. 454-459. DOI: https://doi.org/10.1080/10641963.2016.1273944
  2. Differential expression of MicroRNAs in endarterectomy specimens taken from patients with asymptomatic and symptomatic carotid plaques / B. Markus [et al.] // PLoS One. 2016. N 11. P. 0161632. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0161632
  3. Up-regulation of microRNA-16 in glioblastoma inhibits the function of endothelial cells and tumor angiogenesis by targeting Bmi-1 / F. Chen [et al.] // Anticancer Agents Med Chem. 2016. Vol. 16(5). P. 609-620.
  4. Prevalence of miRNAs in Introns and Cis Regulatory Regions of Genes of the Somatotropic Axis in Mammals / T. Shkurat [et al.] // American Journal of Applied Sciences. 2015. Vol. 12(1). P. 1-7.: 10.3844/ajassp.2015.1.7
  5. Deng L., Bradshaw A.C., Baker A.H. Role of noncoding RNA in vascular     remodeling // Curr Opin Lipidol. 2016. Vol. 27(5). P. 439-48. DOI: https://doi.org/10.1097/MOL.0000000000000336
  6. Emerging roles of circRNA_001569 targeting miR-145 in the proliferation and invasion of colorectal cancer / H. Xie [et al.] // Oncotarget. 2016. Vol. 7(18). P. 26680-91. DOI: 10.18632/oncotarget.8589
  7. FAM83D promotes cell proliferation and motility by downregulating tumor suppressor gene FBXW7 / Z. Wang [et al.] // . 2013. Vol. (12). P. 2476-2486. DOI: 10.18632/oncotarget.1581
  8. Circulating miR-155, miR-145 and let-7c as diagnostic biomarkers of the coronary artery disease / J. Faccini [et al.] // Sci Rep. 2017. N 7. P. 42916. DOI: https://doi.org/10.1038/srep42916
  9. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs / Q. Zheng [et al.] // Nat Commun. 2016. N 7. P. 11215. DOI: https://doi.org/10.1038/ncomms11215
  10. Свойства интронных miRNA человека и особенности их взаимодействия с mRNA / О.А. Берилло [и др.] // Experimental Biology. 2011. Т. 50, N 4. С. 37-41.
  11. Lorenzen J.M., Thum T. Long noncoding RNAs in kidney and cardiovascular diseases // Nat Rev Nephrol. 2016. Vol. 12(6). P. 360-73. DOI: https://doi.org/10.1038/nrneph.2016.51
  12. Оловников А.М. Биологическая эволюция на основе неслучайной изменчивости, регулируемой организмом // Биохимия. 2009. Т. 74, N 12. С. 1722-1728.
  13. Zhang C.Z. Long non-coding RNA FTH1P3 facilitates oral squamous cell carcinoma progression by acting as a molecular sponge of miR-224-5p to modulate fizzled 5 expression // Gene. 2017. Vol. 607. P. 47-55. DOI: https://doi.org/10.1016/j.gene.2017.01.009
  14. Hill A.E., Sorscher E.J. Massive microRNA sequence conservation and prevalence in human and chimpanzee introns // Genome. 2012. Vol. 3079(32884). P. 698069.
  15. Оловников А.М. Роль парагенома в развитии организмов // Онтогенез. 2007. Т. 38, N 2. С. 136-158.
  16. The properties of binding sites of miR-619-5p, miR-5095, miR-5096, and miR-5585-3p in the mRNAs of human genes / A. Ivashchenko [et al.] // BioMed research international. 2014. Vol. 2014. DOI: http://dx.doi.org/10.1155/2014/720715
  17. MicroRNA Binding Sites in Mitochondrial Genes are Associated with the Progression of Atherosclerosis / T. Shkurat [et al.] // Annals Academy of Medicine Singapore. 2016. Vol. 45(suppl), N 9. P. 174.
  18. Romanov D.E., Shkurat T.P. MSCANNER - a genome-wide motif finding tool // The 7-th International Young Scientists School "Sysytem Biology and Bioinformatics", SBB-2015. P. 40.
  19. Калинкин М.Н., Щеглова Н.Е. МикроРНК и полиморфизм генов их биогенеза в патогенезе атеросклероза // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2017. Т. 61, N 1. С. 43-50. DOI: https://doi.org/10.25557/0031-2991.2017.01.43-50
  20. Long non-coding RNA FTH1P3 facilitates uveal melanoma cell growth and invasion through miR-224-5p / X. Zheng [et al.] // PLoS One. 2017. N 12. P. e0184746. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0184746