Введение. Гемoррaгическaя лихoрадкa с пoчечным cиндромoм (ГЛПС) впервыe была описана в китайских писаниях 900 лет назад как заболеваниe, напоминающее хантавирусную инфекцию. Возбудитель заболевания оставался неизвестным до конца 1970-х годов, пока Lee с соавторами не сообщили о вирусе Хантаан (HTNV), присутствующем в легких его естественного резервуара, полосатой полевой мыши (Apodemus agrarius) [1]. Следующей важной вехой изучения хантавирусной инфекции стала вспышка заболевания, названного хантавирусным кардиопульмональным синдромом, произошедшая в регионе Four Corners в США в 1993 г., возбудителем которого оказались хантавирусы Sin Nombre (SNV) и Andes (ANDV), зарегистрированные в Северной и Южной Америке [2].

Наиболее распространенным хантавирусом в Европе является вирус Puumala (Пуумала (PUUV)), относящийся к роду хантавирусов семейства Bunyaviridae [3], переносчиком вируса является рыжая полевка Myodes glareolus, населяющая практически весь континент, за исключением Средиземноморского региона. Большинство случаев, связанных с PUUV, диагностировано в некоторых частях европейской части России, Финляндии, Швеции, а также в Бельгии и Германии [4]. В Республике Башкортостан выявляют самое большое число подтвержденных случаев ГЛПС среди всех субъектов Приволжского Федерального округа [5].

Центральными феноменами патогенеза ГЛПС являются повышенная проницаемость сосудов и острая тромбоцитопения с выраженной проницаемостью микрососудистых русел. Репликация хантавируса происходит в эндотелии сосудов, но, по-видимому, она не вызывает прямых цитопатических эффектов [6]. Цикл репликации хантавируса довольно медленный, что приводит к поздней виремии на 5-10-й день после заражения, что может указывать на персистенцию вируса, а не на острое литическое прогрессирование, наблюдаемое при других вирусных геморрагических лихорадках. В тканях почек пациентов с ГЛПС вирусный антиген был обнаружен наряду с инфильтрацией воспалительных клеток и повреждением канальцев, что свидетельствует о том, что репликация вируса вместе с иммунным ответом участвуют в повреждении тканей [7].

Лабораторная диагностика острых хантавирусных инфекций основывается на серологических данных, поскольку практически у всех пациентов в сыворотке крови при появлении симптомов присутствуют IgM и IgG-антитела [8]. Хантавирусная инфекция также может быть подтверждена обнаружением генома хантавируса в образцах крови или сыворотки с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Хотя наличие виремии может быть разным, вирусная РНК обычно обнаруживается при наличии острой пробы. Также предполагается, что более высокая виремия происходит при более тяжелых хантавирусных инфекциях DOBV, SNV, ANDV по сравнению с более легкими инфекциями, таковой считается вирус PUUV [9].

Несмотря на активное изучение и большое количество публикаций, посвященных исследованиям патогенеза вирусных инфекционных заболеваний, в этиологии и патогенезе ГЛПС остается много неясных вопросов. В пocлeдниe гoды вeдутcя aктивныe иccлeдoвaния рoли микрoРНК при рaзличных вируcных инфeкциях, cущecтвуeт вceгo нecкoлькo публикaций, пocвящeнных изучeнию рoли кoльцeвых, циркулирующих и экзocoмaльных РНК и микрoРНК при вируcнoй инфeкции Hantaan [10]. Выявлeн ряд микрoРНК, кoтoрыe игрaют вaжную рoль в кoнтрoлe бaрьeрнoй функции эндoтeлиaльных клeтoк и мoгут принимaть учacтиe в пaтoгeнeзe ГЛПC.

Сообщается, что микроРНК, высвобождаемая из клеток-мишеней вируса, регулирует вирусную инфекцию и репликацию, а вирусные факторы, в свою очередь, модулируют внутриклеточную экспрессию микроРНК. Предполагают, что вирус оказывает влияние на ключевые микроРНК-регулируемые реакции, протекающие в эндотелиальных клетках, ответственные за поддержание целостности сосудов, тем самым вызывая воспаление и нарушение целостности барьера [11].

Цельисследования. Проанализировать уровни экспрессии микроРНК-126 и микроРНК-218 пациентов с ГЛПС на разных этапах течения болезни.

Материал и методы исследования. Для всех пациентов с ГЛПС диагноз устанавливался высококвалифицированными врачами после сбора клинических и анамнестических данных, получения результатов лабораторно-инструментальных обследований (количество лейкоцитов, количество тромбоцитов, амилаза, липаза, общий билирубин, прямой билирубин, креатинин, азот мочевины крови, протромбиновое время, активированное частичное тромбопластиновое время и уровень кальция в сыворотке). Кроме того, диагноз ГЛПС был подтвержден положительным результатом иммуноферментного анализа (ИФА) на антитела IgM к Хантавирусу серотипа Пуумала (ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России).

Все пациенты были госпитализированы в инфекционные больницы г. Уфы с 2018 года по 2021 годы и дали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. В исследование не включались несовершеннолетние лица, индивиды, отказавшиеся от участия в исследовании и не подписавшие письменного согласия, курильщики и лица, имеющие в анамнезе другие инфекционные заболевания.

Клиническая картина при инфицировании вирусом PUUV варьировала от бессимптомной инфекции до тяжелого течения, но в большинстве случаев имела легкое течение. В типичных формах инфекции можно выделить пять различных фаз: лихорадочную, гипотензивную, олигурическую, полиурическую и реконвалесцентную. Больные обычно поступают в стационар в гипотензивную фазу, когда преобладает синдром капиллярной проницаемости. У пациентов могут наблюдаться легочные инфильтраты и плевральный выпот, перикардиальный выпот и отек забрюшинного пространства. Среди госпитализированных больных менее 5% имеют циркуляторный шок. Маркерами поражения почек у большинства пациентов являются транзиторная протеинурия и гематурия. Гипотензивная фаза сопровождается олигурией и острой почечной недостаточностью. Около 6% пациентов нуждаются во временном диализе. Полиурия, которая может быть значительной, является признаком выздоровления. Геморрагический диатез встречается редко, летальность составляет менее 0,5%. На основании клинических и лабораторных исследований мы выбрали группы пациентов для проведения анализа экспрессии экзосомальных РНК.

Все пациенты, включенные в молекулярно-генетический анализ, были разделены на 3 группы в зависимости от тяжести течения заболевания в соответствии с классификацией Б.З. Сиротина [12] – группа пациентов со среднетяжелым течением, тяжелым течением, а также группа пациентов с тяжелым течением и осложнениями. Клиническая характеристика обследованных приведена в таблице 1.

У пациентов тяжелой формой ГЛПС геморрагический синдром проявлялся кровоизлияниями в склеры, в подкожную клетчатку в местах инъекций, носовыми и желудочно-кишечными кровотечениями, а также макро – и микрогематурией.

Образцы крови пациентов с ГЛПС для проведения молекулярно-генетического анализа были собраны трижды – в начальный лихорадочный период (1-4 дни болезни), полиурический период (15-22 дни болезни) и в период реконвалесценции. Таким образом, каждая группа включала по три образца от каждого пациента с ГЛПС на разных стадиях болезни (в динамике лечения). Отдельно была собрана группа здоровых индивидов (N=100), никогда не переносивших ГЛПС и не имеющих хронических заболеваний почек.

Среднетяжелая группа пациентов с ГЛПС включала 105 образцов РНК, тяжелая – 99 и тяжелая с осложнениями – 84 образца РНК. Забор крови пациентов производился в специальные вакутейнеры со стабилизаторами РНК. Экзосомы выделяли из плазмы крови, полученной двукратным центрифугированием при 4°С (10 мин при 1900 g и 15 мин при 3000 g). с последующим выделением тотальной РНК. Оставшуюся часть плазмы сразу замораживали и хранили при температуре -80°С.

Для выделения экзосомальной РНК использовали 1 мл плазмы крови и набор exoRNeasy Midi Kit (Qiagen, Германия), все манипуляции выполняли в соответствии с протоколом производителя как описано ранее [13]. На следующем этапе была получена кДНК по матрице мРНК с использованием обратной транскриптазы и набора микроРНКCURY LNA RT Kit (Qiagen, Германия). Количественную ПЦР в реальном времени, статистическую обработку полученных результатов проводили как описано ранее [13].

Выбор генов «домашнего хозяйства» основывался на данных литературы. Ряд авторов для исследования уровня экспрессии циркулирующих и экзосомальных микроРНК в плазме или сыворотке крови рекомендовали использовать hsa-микроРНК-16 и has-микроРНК-1228-3p в качестве генов «домашнего хозяйства» [14-17]. Мы следовали данным рекомендациям, поскольку микроРНК hsa-микроРНК-16 и has-микроРНК-1228-3p были описаны как стабильные и высоко экспрессируемые в плазме. Мы осуществляли нормализацию по среднему значению двух данных микроРНК.

Результаты и их обсуждение. Учитывая тот факт, что, по литературным данным до 80% генома хозяина транскрибируется в нетранслируемую РНК, что подчеркивает потенциальную важность некодирующей РНК хозяина во взаимодействии хозяина и вируса, мы предположили, что некодирующие, а именно микроРНК хозяина могут играть ключевые регуляторные роли во время репликации вируса при данной инфекции. На первом этапе исследования мы провели попарное сравнение уровней экспрессии микроРНК-126 и микроРНК-218 пациентов с ГЛПС на разных этапах течения болезни, а именно на стадии лихорадки, полиурической стадии ГЛПС и стадии реконвалесценции. Различия оказались статистически не значимыми (P>0,05) (Рис. 1).

Учитывая то, что экспрессия вышеперечисленных микроРНК изменяется статистически незначимо, они не могут быть использованы в качестве дополнительных диагностических маркеров ГЛПС.

На следующем этапе мы сравнивали экспрессию экзосомальных микроРНК пациентов с ГЛПС в группах с разным течением заболевания – среднетяжелым, тяжелым, тяжелым с осложнениями. При сравнении уровней экспрессии экзосомальных микроРНК в группах пациентов с различной степенью тяжести течения заболевания также не было выявлено статистически значимых изменений уровней экспрессии микроРНК-218 и микроРНК-126 (P>0,05) (Рис. 2).

Анализ экспрессии экзосомальных микроРНК-126 и микроРНК-218 в группе пациентов с ГЛПС по сравнению с группой здорового контроля также не выявил статистически значимых результатов (p>0,05).

Несмотря на достаточно низкую летальность при PUUV-инфекции (0,1-0,4%) [2, 5, 11], заболевание часто приводит к госпитализации, а иногда требует лечения в отделениях интенсивной терапии, включая заместительную почечную терапию. Кроме того, после инфекции PUUV было описано несколько долгосрочных нефрологических, сердечно-сосудистых и эндокринологических последствий. Как было сказано ранее, центральным явлением при хантавирусных инфекциях является повышение проницаемости капилляров, что приводит к повреждению сосудов, отеку различных тканей и снижению артериального давления. Детальные патогенетические механизмы, лежащие в основе этого явления, до сих пор во многом остаются неясными. PUUV не вызывает прямой цитопатологии или апоптоза эндотелиальных клеток, но, тем не менее, инфекция приводит к выраженным изменениям как барьерной функции эндотелия, так и функции инфицированных эндотелиальных клеток [1, 9]. Как правило, PUUV вызывает интенсивный иммунный ответ, в котором участвуют как В-, так и Т-клетки [16]. Цитотоксические Т-клетки могут вызывать повышение проницаемости капилляров, тогда как цитокины и активация комплемента способствуют прогрессированию капиллярного повреждения. Было показано, что несколько иммуновоспалительных маркеров служат индикаторами общей тяжести или некоторых специфических характеристик инфекции PUUV. Существуют данные о биомаркерах, касающихся продолжительности пребывания в стационаре и тяжести острого почечного повреждения, тромбоцитопении и лейкоцитоза. Однако, поскольку точные патогенетические механизмы заболевания не выявлены, невозможно различить, в какой степени активация того или иного биомаркера отражает иммунологическую активацию, нацеленную на элиминацию вируса и в какой степени она обусловлена ​​реакцией на повреждение тканей. Хотя выработка различных медиаторов иммуновоспалительного процесса часто ко-регулируется, разные биомаркеры, вероятно, отражают разные иммунопатогенные характеристики заболевания.

В последние годы несколько исследований показали, что микроРНК могут играть важную роль в заболеваниях человека, вызванных различными вирусами. Предполагают, что они могут влиять на репликацию вируса и изменения транскриптома хозяина во время вирусного заражения. Нарушения экспрессии микроРНК, в свою очередь, могут изменять противовирусный ответ. Некоторые микроРНК кодируются вирусами, экспрессируются в геном хозяина и могут вносить вклад в регуляцию экспрессии генов как хозяина, так и вирусного гена во время заражения. По этой причине взаимоотношения между вирусом и микроРНК представляют собой сложный механизм. Недавние исследования показали, что микроРНК хозяина изменяют вирусный патогенез, регулируя экспрессию генов, а также трансляцию и репликацию вируса [18]. Также установлена роль микроРНК в воспалительных процессах и целостности барьера эндотелиальных клеток [19-22]. Тем не менее, проведено довольно ограниченное количество исследований уровня экспрессии некодирующих РНК в эндотелиальных клетках при заражении ортохантавирусами.

Так, в работе Shuang Lu с соавтор. были исследованы и проанализированы профили экспрессии кольцевых РНК и их потенциальная роль во взаимодействии вируса Хантаан и хозяина с помощью интегрированных омиксных данных секвенирования РНК и микроРНК на ложно-инфицированных и Хантаан-инфицированных эндотелиальных клетках пупочной вены человека. В общей сложности исследователи обнаружили дифференциальную экспрессию 70 кольцевых РНК, 66 микроРНК и 788 мРНК между исследуемыми группами. Дифференциальная экспрессия некоторых РНК была подтверждена методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией. Кроме того, авторы подтвердили, что некоторые дифференциально экспрессируемые РНК, такие как circ_0000479, микроРНК-149-5p, микроРНК-330-5p, микроРНК -411-3p, рецептор группы RIG-I-подобных рецепторов (RIG-I), митохондриальный белок цитидин/уридин монофосфатная киназа 2 (CMPK2), поли(АДФ-рибоза)-полимераза 10 (PARP10) и гуанилат-связывающий белок (GBP1) стимулировали или ингибировали репликацию вируса Хантаан. Обогащающий анализ Gene Ontology (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) показал, что гены-хозяева дифференциально экспрессируемых кольцевых РНК в основном участвуют во врожденном иммунном ответе, сигнальном пути интерферона I типа (IFN) и цитокин-опосредованном иммунном ответе. Кроме того, авторами был проведен комплексный анализ регуляторной сети кольцевых РНК – микроРНК - мРНК. Полученые данные показали, что существует большое количество взаимодействий в данной сети при инфекции вируса Хантаан. С помощью репортерного анализа с двумя люциферазами они подтвердили, что circ_0000479 косвенно регулирует экспрессию рецептор группы RIG-I-подобных рецепторов RIG-I, поглощая микроРНК-149-5p и препятствуя репликации вируса. В исследовании Lu S. с соавторами впервые представлен всесторонний обзор РНК, индуцированных вирусом Хантаан и показало, что сеть обогащенных кольцевых РНК и ассоциированных с кольцевыми РНК конкурентных эндогенных РНК участвует в регуляции инфекции Хантаан, тем самым предлагая новое понимание механизмов, лежащих в основе взаимодействия вирус-хозяин [10].

Также известно, что воспалительные стимулы, такие как интерфероны, лизофосфатидная кислота (LPA), интерлейкины, фактор некроза опухоли и лиганды Toll-подобных рецепторов, которые индуцируются при вирусной инфекции, изменяют экспрессию микроРНК в эндотелиальных клетках, включая, микроРНК-126 [19-22], которая участвует в воспалительной реакции, ангиогенезе и поддержании целостности сосудов [23, 24, 25].

Пониженная экспрессия ряда микроРНК, включая микроРНК-126, наблюдалась у пациентов с Крымско-Конго геморрагической лихорадкой по сравнению с группой контроля, при этом уровень экспрессии микроРНК-126-3p снижался в 45 раз, что было ассоциировано с участием микроРНК-126-3p в продукции интерферона I типа и модулировании патофизиологии иммунного ответа у пациентов [26, 27].

В исследовании, впервые описывающем профиль экспрессии микроРНК в тканях печени при лихорадке денге (in vivo), показана повышенная экспрессия микроРНК-126, которая активирует один из наиболее консервативных путей регуляции у высших эукариот - путь JAK1/STAT3 путем ингибирования транскрипционного фактора типа цинковых пальцев ZEB1. Выявлена ассоциация уровня экспрессии микроРНК-126-5p, микроРНК-122-5p и микроРНК-146a-5p с патогенезом геморрагической лихорадки, вызванной вирусом денге, в тканях печени [28].

В недавнем исследовании обнаружено, что экспрессия микроРНК-126-3p во время фебрильной фазы и фазы выздоровления у детей, инфицированных лихорадкой денге, была значительно ниже, чем у детей с острой лихорадкой, не инфицированных вирусом денге, что свидетельствуют о том, что микроРНК-126-3p участвует в патогенезе инфекции, вызванной вирусом денге [29]. Заражение эндотелиальных клеток хантавирусом AND (ANDV) приводило к снижению экспрессии микроРНК в эндотелиальных сосудах, включая и микроРНК-218, которая связана с регуляцией миграции эндотелиальных клеток и сосудистой проницаемости [21, 30], в результате чего происходили дезинтеграция межклеточных взаимодействий и изменение проницаемости сосудов [31, 32, 33]. Это позволяет предположить, что в инфицированных вирусом эндотелиальных клетках сниженная экспрессия микроРНК-218 усиливает VEGF-направленную проницаемость за счет увеличения экспрессии Robo1 и, снижения регуляции Robo4, который стабилизирует сосудистую сеть, противодействуя сигнальным реакциям VEGF, которые приводят к повышению проницаемости эндотеалиальных сосудов [34, 35]. Изменение экспрессии микроРНК-126, которая регулирует целостность сосудов путем подавления экспрессии мРНК генов SPRED1, кодирующего негативный регулятор MAPK-сигналинга и PIK3R2, кодирующего регуляторную субъединицу p85β класса IA PI3K [24, 25, 30], приводила к повышению их экспрессии. В соответствии с повышенной экспрессией гена SPRED1, уровень фосфо-кофилина был снижен в клетках эндотелия, инфицированных хантавирусом, что усиливало нарушение межклеточного взаимодействия [30].

В другом исследовании были выявлены значительные изменения в экспрессии 14 микроРНК, включая, микроРНК-218 при вирусе денге и вирусе гриппа, что указывает на то, что данные микроРНК могут являться регуляторами генов патогенеза при вирусных инфекциях [36].

Заключение. Таким образом, литературные данные подтверждают роль микроРНК в модуляции генов при ГЛПС, однако оценка экспрессии экзосомальных микроРНК-216 и микроРНК-218 не выявила перспектив их использования в качестве маркеров ГЛПС. Ограниченное число исследований и полученные противоречивые данные требуют дальнейшего изучения в данной области с анализом экспрессии других микроРНК. Понимание роли микроРНК в патогенезе инфекций, вызванных ортохантавирусами, представляет большой интерес, поскольку выявление новых биомаркеров и разработка основанных на микроРНК терапевтических средств для лечения вирусных инфекций, включая ГЛПС, является перспективным направлением исследований.

Информация о финансировании

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и ГФЕН в рамках научного проекта № 21-515- 53017 ГФЕН_а.