Введение. Сахарный диабет – это серьезное хроническое заболевание, которое развивается, когда поджелудочная железа не вырабатывает достаточно инсулина или когда организм не способен эффективно использовать выработанный им инсулин [4]. В настоящее время каждый одиннадцатый житель планеты страдает диабетом, что в общем составляет 425 млн человек, три четверти которых – это люди трудоспособного возраста [12]. По предварительным оценкам исследования NATION, в нашей стране более 6 млн. больных, подавляющее большинство которых имеют диабет 2 типа [2]. Помимо стремительных темпов роста заболеваемости СД2, его характерными особенностями являются тенденция к омоложению возраста дебюта, относительно поздняя диагностика заболевания в связи с длительным бессимптомным течением и полиморбидность, особенно в сочетании с сердечно-сосудистыми заболеваниями и ожирением [3]. К моменту диагностики СД 2 типа у половины пациентов уже присутствуют осложнения, приводящие к снижению качества жизни, ранней инвалидизации и преждевременной смерти. СД 2 типа – это ведущая причина потери зрения, нетравматических ампутаций и развития терминальных стадий почечной недостаточности [1].

Сахарный диабет 2 типа (СД2) входит в группу мультифакториальной патологии и развивается в результате сочетанного действия генетических и средовых факторов. Согласно базе данных GeneCards, 564 гена ассоциированы с различными фенотипами СД2, такими как дисфункция бета-клеток поджелудочной железы и инсулинорезистентность периферических тканей. В результате пятидесяти трех полногеномных исследований, установлено 720 однонуклеотидных вариантов, ассоциированных с заболеванием. Тем не менее, эта информация не дает полного представления о функциональной значимости обнаруженных полиморфизмов и их вклада в формирование того отрицательного метаболического фундамента, на фоне которого происходит манифестация заболевания.

Очень важным и широко обсуждаемым в литературе звеном патогенеза СД2 является нарушение работы антиоксидантной системы, главным представителем которой как внутри, так и вне клеток служит трипептид гамма-глутамилцистеинилглицин, или глутатион. Первым и единственным регуляторным ферментом глутатионового цикла выступает глутаматцистеинлигаза, состоящая из двух субъединиц – каталитической (GCLC) и модифицирующей (GCLM). Гены, кодирующие эти белки, полиморфны и вовлечены в патогенез таких заболеваний, как инфаркт миокарда и бронхиальная астма. Данные о возможном вкладе этих генов в развитии СД2 отсутствуют.

Целью настоящего исследования стало изучение связи полиморфизмов генов GCLC (-129 C>T, rs17883901) и GCLM (-588 C>T, rs41303970) с риском развития СД2 и про/антиоксидантным статусом жителей Курской области.

Материал и методы. На основе письменного информированного согласия в исследование включено 700 больных СД2 (269 мужчин и 431 женщина со средним возрастом 59,24±8,77 лет), получавших стационарное лечение в эндокринологическом отделении Курской городской клинической больницы скорой медицинской помощи с ноября 2015 по май 2017 года. Группу контроля составили 718 практически здоровых добровольцев (311 мужчин и 407 женщин со средним возрастом 58,61±7,65 лет). Диагноз СД2 устанавливался на основании обнаружения гипергликемии ≥7,1 ммоль/л натощак, или гипергликемии ≥11,1 ммоль/л в любое время суток независимо от приема пищи, и/или уровня гликированного гемоглобина ≥6,5% [4]. Лица контрольной группы имели нормальные показатели углеводного обмена. Все обследованные были уроженцами преимущественно Курской области и были неродственны друг другу. Протокол исследования был одобрен Региональным этическим комитетом при Курском государственном медицинском университете.

У всех обследуемых производили забор 6 мл венозной крови натощак в вакуумные пробирки с ЭДТА. Геномную ДНК выделяли стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции [14]. Генотипирование полиморфизмов генов GCLC и GCLM проводили с помощью полимеразно-цепной реакции в режиме реального времени с дискриминацией аллелей TaqMan зондами согласно протоколам, описанным в литературе [9, 11].

Для биохимических исследований, 6 мл венозной крови забирали в вакуумные пробирки с гепарином лития в качестве антикоагулянта и сразу же центрифугировали 10 минут при 3500 об./мин. с охлаждением до 4˚С. Плазму для детекции перекиси водорода аликвотировали по 200 мкл и замораживали при -80˚С. Плазму для определения содержания глутатиона предварительно депротеинизировали ледяным раствором 5%-ой метафосфорной кислоты и центрифугировали 10 минут при 12000 об./мин. Надосадочную жидкость аликвотировали по 100 мкл и замораживали при -80˚С. Непосредственно перед анализом образцы разбавляли десятикратно для снижения концентрации метафосфорной кислоты до 0,5%. Концентрацию H₂O₂ измеряли флуориметрическим методом с использованием набора реагентов ROS/RNS OxiSelect CellBiolabs. Уровень GSSG оценивали колориметрически с помощью набора Total Glutathione CellBiolabs. Абсорбцию и флуоресценцию измеряли на микропланшетном ридере Varioscan Flash (Thermo Fisher Scientific).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью онлайн программы SNPStats. Различия рассматривали как значимые при р≤0,05. Поправку на множественное тестирование вводили с использованием онлайн софта FDR Calculator при уровне значимости Q≤0,2 [6].

Результаты и обсуждение. В таблице 1 приведены данные по сравнительному анализу частот генотипов и аллелей изучаемых генов у больных СД2 и здоровых лиц. Частоты генотипов GCLC и GСLM между группами пациентов с СД2 и контроля не отличались (р>0,05). При раздельном сравнении больных мужчин и женщин с контролем было выявлено, что генотипы С/Т и Т/Т гена GCLC ассоциированы с повышенным риском развития заболевания только в подгруппе мужчин (OR 1,65, 95CI 1,05-2,61, p=0,03) с учетом коррекции по полу, возрасту и индексу массы тела; также в группе больных СД2 мужчин обнаружено и более частое (10,4%) по сравнению со здоровыми (6,4%) носительство редкого аллеля Т гена GCLC (OR 1,69, 95CI 1,11-2,58, p=0,02).

Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей изучаемых генов

Table 1

Comparative analysis of frequencies of the studied gene genotypes and alleles

Учитывая мультифакториальную природу СД2, нам представлялось важным оценить вклад курения как фактора риска в предрасположенность к развитию заболевания. Оказалось, что ассоциация генотипов С/Т и Т/Т гена GCLC с риском развития СД2 есть только в подгруппе больных диабетом курящих мужчин (OR 2,36, 95CI 1,19-4,65, p=0,01, таблица 2) и отсутствует у некурящих (таблица 3). Эта ассоциация осталась значимой и после поправки на множественное тестирование (Q=0,12).

Сравнительный анализ частот генотипов изучаемых генов среди курящих

Table 2

Comparative analysis of frequencies of the studied gene genotypes
and alleles in smokers

Таблица 3

Сравнительный анализ частот генотипов изучаемых генов среди некурящих

Table 3

Comparative analysis of frequencies of the studied gene genotypes
and alleles in non-smokers

Анализ биохимических показателей редокс-статуса обследуемых показал, что уровни перекиси водорода и окисленного глутатиона значимо выше в группе пациентов с СД2 (р=0,024 и 0,004, соответственно) по сравнению с контролем (таблица 4). Это же характерно и для подгруппы больных СД2 мужчин. Стратификационный анализ концентрации H₂O₂ и GSSG по курению выявил значимо более высокие уровни
этих показателей у всех курящих в общем и курящих мужчин в частности (таблица 5); в группе некурящих различий по содержанию H₂O₂ и GSSG обнаружено не было (таблица 6).

Концентрации H₂O₂ и GSSG в плазме больных СД2 и здоровых лиц

Table 4

H₂O₂ and GSSG plasma levels in T2D patients and healthy subjects

Таблица 5

Концентрации H₂O₂ и GSSG в плазме курящих больных СД2 и здоровых лиц

Table 5

H₂O₂ and GSSG plasma levels in T2D patients-smokers and healthy subjects

Таблица 6

Концентрации H₂O₂ и GSSG в плазме некурящих больных СД2 и здоровых лиц

Table 6

H₂O₂ and GSSG plasma levels in T2D patients non-smokers and healthy subjects