Введение. Современные достижения в области медицинской генетики позволили обнаружить широкий спектр геномной патологии, ассоциированной с умственной отсталостью, аутизмом, эпилепсией и/или врожденными пороками развития [2, 4, 25]. Особое место среди различных форм генетических нарушений, ассоциированных с патологией центральной нервной системы, занимает хромосомная нестабильность. В настоящее время известно, что эта форма соматической вариабельности генома на хромосомном уровне является одним из распространенных механизмов болезней, вызванных нарушением развития центральной нервной системы, а также нейродегенеративных заболеваний [1, 4, 9, 15]. Более того, ранее было высказано предположение о том, что некоторые формы хромосомной нестабильности (например, спорадическая анеуплоидия и неспецифические структурные хромосомные аномалии) могут быть использованы в качестве маркеров для идентификации аномальных процессов (каскадов процессов), приводящих к патологии центральной нервной системы [15, 24].

В современной литературе геномная (хромосомная) нестабильность преимущественно рассматривается в онкологическом контексте, являясь как одним из основных механизмов широко распространенных жизнеугрожающих раковых заболеваний, так и надежным биомаркером малигнизации клеточных популяций [4, 11, 17, 19, 21]. Тем не менее, известно, что хромосомная нестабильность может быть одним из ключевых элементов патогенетического каскада молекулярных и клеточных процессов, связанных с нарушениями репродукции [19], почечной патологией [16], нервными и психическими болезнями [15, 22], а также причиной различных изменений психики, вызванных отрицательным воздействием окружающей среды на организм человека [18]. Помимо этого, предполагается, что подобные изменения соматического генома могут быть одной из причин старения организма на тканевом и клеточным уровнях [23]. Однако, анализируя работы, посвященные хромосомной нестабильности, можно сделать обоснованный вывод о том, что она практически некогда не рассматривалась в контексте биомаркеров болезней мозга, несмотря на значимую роль в патогенезе нарушений центральной нервной системы [1, 4, 15, 22, 24]. Биомаркеры представляют собой изменения в тканях, клетках или биологических жидкостях организма, характерные для определенного патологического состояния, которые могут быть объективно и воспроизводимо измерены с помощью методов клеточной или молекулярной биологии [8, 20]. Поскольку хромосомная нестабильность полностью соответствует данному определению, ее оценка в качестве биомаркера аномальных процессов, приводящих к нарушению функционирования центральной нервной системы у детей, является обоснованной.

Цель исследования. Целью настоящего исследования явилась оценка потенциала использования наличия различных форм хромосомной нестабильности в качестве биомаркеров неонкологических болезней мозга у детей при молекулярной и клеточной диагностике геномной патологии с целью идентификации механизмов патогенеза заболевания.

Материалы и методы. Тысяча детей с умственной отсталостью, аутизмом, эпилепсией и/или врожденными пороками развития были исследованы с помощью цитогенетических методов G- и С-окрашивания [3]. При цитогенетическом анализе хромосомной нестабильности исследовалось не менее 30 метафазных пластинок (клеток) для каждого пациента. Молекулярно-цитогенетическое исследование проводилось методом флюоресцентной гибридизации insitu (FISH) с использованием оригинальных хромосомоспецифичных ДНК проб [1, 3, 4] и включало в себя анализ 100 метафазных пластинок и 1000 интерфазных ядер для каждого исследованного пациента. Данные результатов молекулярного кариотипирования (разрешение сканирования генома не менее 1 тыс. пн) были обработаны с использованием оригинального биоинформатического метода оценки функциональных последствий геномных вариаций в виде изменения числа копий последовательностей ДНК и геномной нестабильности [4, 15], основанный на исследовании межтканевой вариабельности экспрессии генов, вовлеченных в перестройку insilico, интерактомном анализе белков, кодируемых этими генами, и идентификации возможных изменений «молекулярных путей» (pathways), вызванных регулярными (наследуемыми или denovo) геномными вариациями.

Результаты и обсуждение. У 108 детей с умственной отсталостью, аутизмом, эпилепсией и/или врожденными пороками развития (10.8%) была обнаружена хромосомная нестабильность, которая проявлялась в виде анеуплоидии, крупных структурных перестроек (транслокации, делеции, дупликации, инверсии), ломкости хромосом и хромосомных разрывов. В случаях проявления хромосомной нестабильности в виде анеуплоидии была использована FISH с оригинальными хромосомоспецифичными ДНК пробами. Хромосомная нестабильность в виде мносомии и трисомии была подтверждена. В 31-ом случае было использовано молекулярное кариотипирования в сочетании с оригинальным биоинформатическим методом поиска геномных вариаций, которые могли бы быть причиной хромосомной нестабильности. Во всех исследованных случаях были выявлены вариации числа копий последовательностей ДНК в количестве от 4 до 9 на каждый геном, которые имеют функциональные последствия для таких «молекулярных путей» (pathways), как сохранность стабильности генома, репарация/репликация ДНК, регуляция клеточного цикла и запрограммированной гибели клеток. Согласно литературным данным [4, 5, 12, 15, 17], подобные нарушения вышеуказанных «кластеров» молекулярных и клеточных процессов приводят к хромосомной нестабильности. Таким образом, учитывая полученные данные и предыдущие исследования [1, 4, 6, 12-15, 26], можно сделать вывод о том, что в описываемых случаях умственной отсталости, аутизма, эпилепсии и врожденных пороков развития хромосомная нестабильность является одним из ключевых элементов патогенетического каскада заболевания и, как следствие, может быть признана механизмом возникновения фенотипических проявлений. Примечательно, что изменения «молекулярных путей» регуляции клеточного цикла и запрограммированной гибели клеток, в основном, ассоциировались с такими формами хромосомной нестабильности, как анеуплоидия. Геномные вариации, связанные с модифицирующим эффектом «молекулярных путей» сохранности стабильности генома и репликации/репарации ДНК были преимущественно обнаружены при нестабильности, проявляющейся в виде крупных структурных перестроек, ломкости хромосом и хромосомных разрывов. Следовательно, обоснован вывод о том, что различные типы хромосомной нестабильности могут служить биомаркерами аномальных процессов, приводящих к нарушению функционирования центральной нервной системы у детей.

В настоящее время известно большее число геномных вариаций, приводящих к хромосомной нестабильности [4, 5, 17]. В частности, нарушения определенных молекулярных и клеточных процессов, ассоциированных с регуляцией сохранности стабильности генома и репликации/репарации ДНК, могут быть причиной ломкости хромосом [7, 10]. Примечательно, что в настоящей работе были выявлены вариации числа копий последовательностей ДНК, затрагивающие гены, которые вовлечены в соответствующие «молекулярные пути», у детей с ломкостью хромосом. Наименее изученными формами хромосомной нестабильности с точки зрения причин их возникновения являются тканеспецифические изменения числа, нарушения морфологии и разрывы хромосом. Тем не менее, в литературе имеются данные, позволяющие выделить ряд процессов-кандидатов возникновения этих форм хромосомной нестабильности, которые входят в «молекулярные пути» сохранности стабильности генома, репарацию/репликацию ДНК, регуляцию клеточного цикла и запрограммированной гибели клеток [1, 14, 15, 26]. В связи с вышесказанным, видится необходимым учитывать регулярные геномные вариации, которые ассоциированы с хромосомной нестабильностью, при молекулярной диагностике с целью определения механизма заболевания.

Вариабельность соматического генома является одним из основных механизмов генетической вариабельности на клеточном, тканевом и межиндивидуальном уровнях [6]. Примечательно, что изменения структуры и поведения генома в соматических клетках являются также элементом патогенетического каскада процессов при психических и нейродегенеративных заболеваниях [1-4, 22]. Более того, изменения структуры и морфологии хромосом могут быть результатом отрицательного воздействия окружающей среды, приводя к функциональным нарушениям различных систем организма человека, включая центральную нервную систему [12, 13, 18]. Следовательно, помимо определения причинно-следственной связи между фактом наличия хромосомной нестабильности и вариабельностью генома, имеет значение также мониторинг и более детальный цитогенетический (молекулярно-цитогенетический) анализ типов изменения структуры, числа и морфологии хромосом. К сожалению, на сегодняшний день подобный подход к диагностическим исследованиям хромосомной нестабильности крайне редок.

Учитывая потенциальную диагностическую ценность анализа особенностей и причин возникновения хромосомной нестабильности, являющейся биомаркером патологических процессов при нервно-психических болезнях у детей, было признано целесообразным пересмотреть общепринятую последовательность действий при идентификации хромосомных аномалий. Цитогенетический анализ и молекулярное кариотипирование обычно рассматриваются, как два последовательных этапа диагностики хромосомных аномалий, несмотря на то, что массивы данных, полученных с помощью каждого из этих методов, являются взаимодополняющими, а не иерархическими (например, нередко ошибочно утверждается, что данные цитогенетического анализа вторичны по отношению к результатам молекулярного кариотипирования, или же диагностика хромосомной патологии сводится к проведению исключительно молекулярного кариотипирования) [4, 24]. Проведенное исследование указывает на то, что для увеличения эффективности диагностики хромосомных аномалий за счет идентификации механизма заболевания требуется ряд дополнений. В частности, цитогенетический анализ целесообразно дополнить цитогенетическими и молекулярно-цитогенети­ческими исследованиями генома в большем числе клеток, регистрируя все типы изменения структуры, числа и морфологии хромосом, а молекулярное кариотипирование, в свою очередь, дополнить биоинформатической оценкой последствий регулярных (структурных) геномных вариаций в контексте их возможного эффекта на «молекулярные пути» сохранности стабильности генома, репарации/репликации ДНК регуляции клеточного цикла и запрограммированной гибели клеток. В результате внедрения в протоколы диагностики хромосомной (геномной) патологии у детей предлагаемых дополнений алгоритм идентификации молекулярных и клеточных механизмов заболевания, обусловленного хромосомной нестабильностью, будет выглядеть следующим образом: параллельно получается два массива данных: (1) цитогенетические и молекулярно-цитогенетические данные о характере хромосомной нестабильности; (2) данные молекулярного кариотипирования; далее, с помощью биоинформатического анализа второго массива и корреляции его с первым получается возможность определения причины

Рис. Схематическое изображение алгоритма идентификации молекулярных и клеточных механизмов заболевания, обусловленного хромосомной нестабильностью. В отличие от общепринятой последовательности действий при молекулярной диагностике хромосомной патологии рекомендуется проводить более детальный анализ хромосомной нестабильности и определение ее возможных причин по данным молекулярного кариотипирования

Fig. Schematic representation of the algorithm for identification of molecular and cellular mechanisms of the disease caused by chromosomal instability. In contrast to the generally accepted sequence of actions for molecular diagnostics of chromosomal pathology, it is recommended to conduct a more detailed analysis of chromosomal instability and to determine its possible causes according to data of molecular karyotyping