МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АССОЦИАЦИЙ КОМБИНАЦИЙ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ СИСТЕМЫ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ С РАЗВИТИЕМ ИЗОЛИРОВАННОГО ДЕФЕКТА МЕЖЖЕЛУДОЧКОВОЙ ПЕРЕГОРОДКИ В КРАСНОДАРСКОМ КРАЕ
Aннотация
Актуальность: Изучение вовлеченности полиморфизма генов-кандидатов системы биотрансформации ксенобиотиков в формирование врожденных пороков развития у детей является одной из актуальных задач современной медицины. Цель исследования: Определить ассоциации комбинаций полиморфизмов генов системы биотрансформации ксенобиотиков с предрасположенностью формирования дефекта межжелудочковой перегородки (ДМЖП) у детей в Краснодарском крае. Материалы и методы: В исследование включены дети с верифицированным ДМЖП (100 человек), средний возраст 3.11±0.81 лет. Группой популяционного контроля явились родители детей с ДМЖП, не имеющие врожденных пороков развития. Все исследуемые имели славянскую национальность и являются коренными жителями Краснодарского края. Проведены выделение ДНК и амплификация полиморфизмов генов в режиме реального времени; проведен анализ полученных генотипов при помощи метода дискриминации аллелей. Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборке больных и здоровых использовали критерий χ2. Результаты: Показана статистическая достоверность 5 комбинаций генотипов, имеющих повышенный риск формирования ДМЖП: CYP1B 1432AA х NAT2 590GG, CYP1B1 432GG х CYP3A4 664TT, CYP3A4 664TT х CYP3A5 6986AA – для лиц мужского пола, CYP1B1 432AG х NAT2 590АА, CYP2C9 1075AC х CYP3A4 664TC – для лиц женского пола, с показателями (р<0.05, OR=3.29, 95% CI=1.11-9.74), (р<0.05, OR=14.23, 95% CI=1.72-117.86), (р<0.05, OR=4.75, 95% CI=0.98-23.10), (р<0.05, OR=2.66, 95% CI=0.95-7.41), (р<0.05, OR=7.07, 95% CI=0.77-64.83) соответственно и 3 комбинации протективного характера NAT2 590GA х ABCB1 3435CT (р<0.05, OR=0.37, 95% CI=0.15-0.94), CYP1B1 432АА х CYP2C9 1075AA (р<0.05, OR=0.40, 95% CI=0.17-1.00) – для лиц мужского пола, CYP2C9 1075AC х CYP3A56986AA (р<0.05, OR=0.36, 95% CI=0.13-1.03) – для лиц женского пола. Заключение: Установлены 8 парных сочетаний генотипов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, ассоциированных с риском развития изолированного дефекта межжелудочковой перегородки.
Ключевые слова: врожденный дефект межжелудочковой перегородки (ДМЖП), ферменты биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), полиморфизм, маркер предрасположенности, Краснодарский край
Введение. Врожденные пороки сердца являются актуальной медико-социальной проблемой со значительным колебанием показателей распространенности как в различных странах мира, так и в регионах Российской Федерации (3.17-8.00‰) [1, 2, 3]. ВПС составляют незначительный удельный вес в общей заболеваемости детей (2%). Однако вклад ВПС в формирование младенческой смертности и детской инвалидности более значителен. В Российской Федерации зарегистрированы около 25.7 тыс. детей-инвалидов по причине ВПС, из них 40.9% в возрасте от 0 до 4 лет, 10.3% – 15-17-летних [4].
Изолированные случаи дефекта межжелудочковой перегородки (ДМЖП) – занимает лидирующее положение в структуре врожденных пороков развития системы кровообращения (ВПР СК) в Краснодарском крае (51.8%) с частотой среди новорожденных 7.96‰ [5] и имеют мультифакториальную природу. На сегодняшний день накоплено значительное число данных научной литературы свидетельствуют в пользу вовлеченности различных полиморфных генов в формирование предрасположенности к патологии мультифакториального генеза. Именно гены ферментов детоксикации ксенобиотиков, экспрессия которых зависит от внешне-средовых факторов и участвуют в развитии предрасположенности к формированию ДМЖП, и представляют собой интерес для исследований этиологии мультифакториальных заболеваний [6, 7, 8, 9, 10]. В связи с этим, представляется целесообразным тестирование полиморфных вариантов Val432Leu CYP1B1, G590A NAT2, 3435T ABCB1, A1075C CYP2C9, T664C CYP3A4, +6986G/A CYP3A5 в качестве маркеров предрасположенности к формированию ДМЖП.
Цель работы – определить ассоциации полиморфизмов Val432Leu CYP1B1, G590A NAT2, 3435T ABCB1, A1075C CYP2C9, T664C CYP3A4, +6986G/A CYP3A5 с предрасположенностью к ДМЖП у детей Краснодарского края.
Материалы и методы исследования. Основным объектом настоящего исследования явились дети с ДМЖП (100 человек), родившиеся в 1998-2012гг из 38 территориальных образований и 6 городов Краснодарского края. Средний возраст детей с ДМЖП составил 3.11±0.81 лет (46 мальчиков – 46% и 64 девочки – 64%). Группой популяционного контроля явились родители детей с ДМЖП, не имеющие врожденных пороков развития, также славянской национальности и являющиеся коренными жителями Краснодарского края.
Для систематизации и статистической обработки данных была сформирована электронная база с включенными сведениями каждого пробанда.
С целью верификации диагноза всем больным было проведено комплексное обследование, включающее клинические методы с использованием физикального обследования, анкетирования, и специальные (ЭКГ, УЗИ, рентгенографии сердца и др.), а также клинико-генеалогический, цитогенетический методы исследования.
ДНК выделяли из замороженной крови стандартным методом фенольно-хлороформной экстракции. Анализ полиморфизмов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков осуществляли методом полимеразной цепной реакции с соответсвующим анализом данных в амплификаторе CFX96 Bio-rad и Rotor Gene Q5 plex HRM (Qiaqen) в режиме Real time с использованием полимеразы Thermus aquaticus (Taq-полимераза), производства фирмы «СибЭнзим», олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» (таблица 1) с дальнейшим проведением ПЦР и анализированием полученных генотипов при помощи метода дискриминации аллелей. Ход протоколов изучаемых полиморфизмов представлен в таблице 2.
Таблица 1
Праймеры и зонды, примененные для типирования ДНК-маркеров методом TaqMan зондов в режиме RealTime
Table 1
Primers and probes used for typing DNA markers using the Taq Man probes method in Real Time mode
Ген | Полиморфизм | Структура праймеров и зондов | Источник |
CYP1B1 | Val432Leu | F: 5’- tgt caa cca gtg gtc tgt gaa tc -3’ R: 5’- tca ctc tgc tgg tca ggt cct t -3’ 5’-FAM-accca(g-LNA)tgaagtgg-RTQ1-3’ 5’-ROX-atgaccca(c-LNA)tgaagtg-BHQ2-3’ | [11] |
NAT2 | G590A | F: 5’- ctgccaaagaagaaacaccaaaa -3’ R: 5’- tggagacgtctgcaggtatgtatt -3’ 5’-FAM- acctc(g-LNA)aacaattg-RTQ1-3’ 5’-ROX-tgaacctc(a-LNA)aacaatt-BHQ2-3’ | [12] |
ABCB1
| C3435T | F: 5’- ctgtttgactgcagcattgct -3’ R: 5’- atgtatgttggcctcctttgct -3’ 5’-FAM-ccctcac(a - LNA)atctctt-RTQ1-3’ 5’-ROX-ccctcac(g-LNA)atctctt-BHQ2-3’ | [8] |
CYP2C9 | A1075C | F: 5’- gccacatgccctacacagatg -3’ R: 5’- gaatttaatgtcacaggtcactgcat -3’ 5’-FAM-aaggtcaa(g-LNA)gtatctc-RTQ1-3’ 5’-ROX- aggtcaa(t-LNA)gtatctct-BHQ2-3’ | [13] |
CYP3A4 | T664C | F: 5’- tggaatgaggacagccatagaga -3’ R: 5’- agtggagccattggcataaaatct -3’ 5’-FAM-aagggca(g-LNA)gagagag-RTQ1-3’ 5’-ROX-aagggca(a-LNA)gagagag-BHQ2-3’ | [14] |
CYP3A5 | +6986G/A | F: 5’- tgaagggtaatgtggtccaaacag -3’ R: 5’- cgaatgctctactgtcatttctaacca -3’ 5’-FAM- tttgtctttca (a-LNA)tatctc-RTQ1-3’ 5’-ROX-ttttgtctttca (g-LNA)tatctc-BHQ2-3’ | [14] |
Таблица 2
Протоколы генотипирования
Table 2
Protocols of genotyping
Ген, t0 отжига | Полимор-физм | Профиль |
CYP1B1 48 оС | Val432Leu | Смесь реакционных компонентов объемом 25 мкл из расчета на 1 образец включает: бидистиллированная деионизированная вода 18.1мкл, ионы магния 2.5 мкл, буфер 2.5 мкл, дезоксирибонуклеозидфосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 0.4 мкл, праймер F 0.1 мкл, праймер R 0.1 мкл, зонд FAM 0.05мкл, зонд ROX 0.05 мкл, Taq-полимераза 0.2 мкл, ДНК 1 мкл. Процесс генотипирования проводился при помощи метода Taq Man зондов по изменению уровня относительной флуоресценции используемых зондов (величины RFU) на амплификаторе с флюо ресцентной детекцией CFX96 (Bio-rad). По окончании первого этапа – денатурации при 95 оС с временем экспозиции 5 минут осуществлялось 40 непрерывных циклов амплификации, включающих отжиг праймеров в течение 60 секунд при 45-51.3 оС и денатурация в течение 15 сек при 95 оС. |
NAT2 45 оС | G590A | |
ABCB1 51.3 оС | C3435T | |
CYP2C9 45 оС | A1075C | Смесь реакционных компонентов объемом 25 мкл из расчета на 1 образец включает: бидистиллированная деионизированная вода 17.1мкл, ионы магния 2.5 мкл, буфер 2.5 мкл, дезоксирибонуклеозидфосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 0.4 мкл, праймер F 0.1 мкл, праймер R 0.1 мкл, зонд FAM 0.05 мкл, зонд ROX 0.05 мкл, Taq-полимераза 0.2 мкл, ДНК 2 мкл. Процесс генотипирования проводился при помощи метода Taq Man зондов по изменению уровня относительной флуоресценции используемых зондов (величины RFU) на амплификаторе с флюоресцентной детекцией Rotor Genе Q 5 plex HRM (Qiaqen). По окончании первого этапа – денатурации при 95 оС с временем экспозиции 5 минут и удержанием температуры 5 сек при 72 оС, осуществлялось 40 непрерывных циклов амплификации, включающих отжиг праймеров в течение 60 секунд при 45 оС и денатурация в течение 15 сек при 95 оС. |
CYP3A4 45 оС | T664C | |
CYP3A5 45 оС | +6986G/A |
Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга и для сравнения распределений частот генотипов и аллелей в выборке больных и здоровых использовали критерий χ2 [15]. Уровень статистической значимости различий между группами принимали р≤0.05. Об ассоциации аллелей и генотипов с предрасположенностью к ДМЖП судили по величине отношения шансов (ОR) [13]. Границы 95%-го доверительного интервала (СI) для ОR вычисляли методом В. Woolf. Уровень статистической значимости для D – показатель, отражающий различия между наблюдаемыми и ожидаемыми отношениями гаплотипов специфических аллелей двух локусов при нулевой гипотезе (Н0) о независимости их наследования рассчитывали с помощью критерия χ2 для таблиц сопряженности 2×2 [16].
Результаты и их обсуждение. Анализ распределения генотипов изучаемых полиморфных генов Val432Leu CYP1B1, G590A NAT2, 3435T ABCB1, A1075C CYP2C9, T664C CYP3A4, +6986G/A CYP3A5 показал, что эмпирическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (>0.05), но эмпирическое распределение генотипов G590ANAT2 не соответствует теоретически ожидаемому в связи с уменьшением фактического уровня гетерозиготности (р<0.05). Уровень аллельного разнообразия по данным локусам составил Н0 =0.49 (для локуса Val432LeuCYP1B1), Н0=0.35 (для локуса G590ANAT2), Н0= 0.45 (для локуса C3435T ABCB1), Н0 =0.49 (для локуса A1075C CYP2C9), Н0=0.35 (для локуса T664C CYP3A4), Н0= 0.45 (для локуса +6986G/A CYP3A5) среди индивидуумов с ДМЖП и Н0 =0.49 (для локуса Val432LeuCYP1B1), Н0=0.41 (для локуса G590ANAT2), Н0= 0.53 (для локуса C3435T ABCB1), Н0 =0.17 (для локуса A1075C CYP2C9), Н0=0.13 (для локуса T664C CYP3A4), Н0= 0.14 (для локуса +6986G/A CYP3A5) в популяционной выборке.
Статистически значимых различий в частотах аллелей изучаемых полиморфных вариантов генов ФБК между группами больных ДМЖП и здоровых не установлено (р>0.05), но наблюдается протективное накоплению аллеля 664C CYP3A4 в группе здоровых (0,070) в отличие от больных ДМЖП (0.030) (р=0.05, OR=0.41, 95% СI=0.16-1.04).
При сравнительном анализе частот генотипов исследуемых полиморфизмов генов ФБК в группе больных ДМЖП и здоровых индивидов статистически значимых различий не установлено (р>0.05), установлено протективное накоплением генотипов 664ТТ CYP3A4 и 664ТС CYP3A4 в отношении риска развития ДМЖП (χ2=3.99, р=0.05, OR=0.39, 95% СI=0.15-1.01).
Данные анализа парных сочетаний генотипов исследуемых полиморфизмов приведены в сводной таблице 3. Выявлены 3 комбинации, ассоциированные с повышенным риском развития ДМЖП: CYP1B1 432GG х NAT2 590GА, CYP1B1 432AA х ABCB1 3435ТТ, CYP3A4 664TT х CYP3A5 6986AA для которых были установлены статистически значимые различия (р<0.05, OR=2.81, 95% CI=1.06-7.39), (р<0.05, OR=2.41 95% CI=1.07-5.43), (р<0.05, OR=2.53, 95% CI=1.14-5.59) и 1 протективная CYP2C9 1075AA х CYP3A4 664TC (р<0.05, OR=0.22, 95% CI=0.05-0.97) соответственно.
Таблица 3
Распределение частот парных сочетаний генотипов генов ФБК в группах больных ДМЖП и здоровых индивидов
(абс, %)
Table 3
Frequency distribution of paired combinations of genotypes of FBK genes in groups of patients with VSD and healthy individuals (abs,%)
Комбинации генотипов | Больные ДМЖП (n=100) | Контроль (n=150) | Критерий различия χ2 (р) | OR (95% CI) |
CYP1B1 432GG х NAT2 590GА | 3 (3.0) | 7 (4.6) | 4.66(0.03)* | 2.81(1.06-7.39) |
CYP1B1 432AA х ABCB1 3435ТТ | 16 (16.0) | 11(7.3) | 4.68(0.03)* | 2.41(1.07-5.43) |
CYP2C9 1075AA х CYP3A4 664TC | 2(2.0) | 13(8.7) | 4.73(0.03)* | 0.22(0.05-0.97) |
CYP3A4 664TT х CYP3A5 6986AA | 91(91.0) | 120(80.0) | 5.51(0.02)* | 2.53(1.14-5.59) |
*- статистически достоверные ассоциации
* - statistic significant associations
На следующем этапе работы нами проанализировано влияние ассоциаций парных сочетаний генотипов полиморфных вариантов генов-кандидатов на риск формирования изолированного ДМЖП и раздельно у лиц мужского и женского пола. Стратифицированный анализ по полу комбинаций полиморфных вариантов генов ФБК, проводившийся в группах, где мальчики с ДМЖП сравнивались с отцами, а девочки с ДМЖП с матерями представлен в таблице 4.
Таблица 4
Распределение частот парных сочетаний генотипов генов ФБК
в группах больных ДМЖП и здоровых индивидов в зависимости
отпола (абс, %)
Table 4
Frequency distribution of paired combinations of genotypes of FBK genes
in groups of patients with VSD and healthy individuals depending on gender (abs,%)
Комбинации генотипов | Больные ДМЖП | Контроль | Критерий различия | OR (95% CI) | |||
n | % | n | % | χ2 | (р) | ||
Муж. (n=40) | Отцы (n=50) | ||||||
CYP1B 1432AA х NAT2 590GG | 12 | 30.0 | 6 | 11.5 | 4.90 | 0.03* | 3.29 (1.11-9.74) |
NAT2 590 GA х ABCB1 3435CT | 9 | 22.5 | 22 | 44.0 | 4.55 | 0.03* | 0.37 (0.15-0.94) |
CYP1B1 432АА х CYP2C9 1075AA | 11 | 27.5 | 24 | 48.0 | 3.93 | 0.05* | 0.40 (0.17-1.00) |
CYP1B1 432GG х CYP3A4 664TT | 9 | 22.5 | 1 | 2.0 | 9.46 | 0.002* | 14.23 (1.72-117.86) |
CYP3A4 664TT х CYP3A5 6986AA | 38 | 95.0 | 40 | 80.0 | 4.33 | 0.04* | 4.75 (0.98-23.10) |
Жен. (n=60) | Матери (n=100) | ||||||
CYP1B1 432AG х NAT2 590АА | 10 | 16.7 | 7 | 7.0 | 3.69 | 0.05* | 2.66 (0.95-7.41) |
CYP2C9 1075AC х CYP3A4 664TC | 4 | 6.7 | 1 | 1.0 | 3.98 | 0.05* | 7.07 (0.77-64.83) |
CYP2C9 1075ACх CYP3A56986AA | 5 | 8.3 | 20 | 20.0 | 3.87 | 0.05* | 0.36 (0.13-1.03) |
*- статистически достоверные различия
* - statistic significant differences
Из 8 выявленных комбинаций генотипов, имеющих статистическую достоверность 5 имели повышенный риск формирования ДМЖП: CYP1B 1432AA х NAT2 590GG, CYP1B1 432GG х CYP3A4 664TT, CYP3A4 664TT х CYP3A5 6986AA – для лиц мужского пола, CYP1B1 432AG х NAT2 590АА, CYP2C9 1075AC х CYP3A4 664TC – для лиц женского пола, с показателями (р<0.05, OR=3.29, 95% CI=1.11-9.74), (р<0.05, OR=14.23, 95% CI=1.72-117.86), (р<0.05, OR=4.75, 95% CI=0.98-23.10), (р<0.05, OR=2.66, 95% CI=0.95-7.41), (р<0.05, OR=7.07, 95% CI=0.77-64.83) соответственно и 3 комбинации протективного характера NAT2 590GA х ABCB1 3435CT (р<0.05, OR=0.37, 95% CI=0.15-0.94), CYP1B1 432АА х CYP2C9 1075AA (р<0.05, OR=0.40, 95% CI=0.17-1.00) – для лиц мужского пола, CYP2C9 1075AC х CYP3A56986AA (р<0.05, OR=0.36, 95% CI=0.13-1.03) – для лиц женского пола.
Нами проведено изучение полиморфных вариантов генов ФБК на этнически гомогенной выборке русских жителей Краснодарского края больных врожденным изолированным ДМЖП. Основываясь на данные научной литературы, мы предположили, что полиморфизмы Val432Leu CYP1B1, G590A NAT2, 3435T ABCB1, A1075C CYP2C9, T664C CYP3A4, +6986G/A CYP3A5, как гены ФБК могут быть ассоциированы с развитием врожденного изолированного ДМЖП.
Заключение. Таким образом, при анализе парных сочетаний полиморфных вариантов генов ФБК установлены 8 статистически значимых ассоциаций с риском развития ДМПП: 4 из них ассоциировалась с повышенным риском порока, а 4, напротив, ассоциировалась с пониженным риском изучаемого ВПР СК. Результаты, полученные при анализе межгенных комбинаций посредством оценки ассоциаций парных сочетаний генотипов ФБК, демонстрируют их тесное взаимодействие, что отражает вовлеченность различных метаболических путей детоксикации ксенобиотиков. Учитывая относительно малочисленность обследованных групп и потенциальную вовлеченность других генов ФБК в развитие ДМЖП, для разработки модели прогнозирования риска развития порока в рамках медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики супружеских пар с отягощенным семейным анамнезам необходим дальнейший поиск молекулярно-генетических маркеров.
В отношении данной статьи не было зарегистрировано конфликта интересов.
Список литературы