Введение. Нарушение функции жевательного аппарата ведет к снижению качества жизни пожилых людей, поэтому важно разрабатывать новые подходы к диагностике и методы терапии заболеваний, связанных с патологией пародонта [1]. Особенностями течения болезней у пожилых людей являются множественные патологические изменения, быстрое ухудшение состояния при поздней диагностике и отсутствии лечения, высокая частота осложнений, необходимость длительной реабилитации и социализации. В связи с этим, заболевания тканей пародонта являются актуальной проблемой современной геронтостоматологии и гериатрии.

Нарушение гомеостаза при хроническом генерализованном пародонтите приводит к смещению равновесия между синтезом и резорбцией ткани в сторону деструкции [2]. Высокая концентрация хемокинов вызывает активацию лейкоцитов в соединительной ткани. При этом высвобождается большой объем литических ферментов (кислые гидролазы, эластазы, нейтральные протеазы), которые разрушают собственные ткани организма [3].

Изменение клеточного обновления и дифференцировки буккального эпителия (БЭ), экспрессия различных сигнальных молекул показывает трансформацию функциональной активности клеток БЭ и во многом отражает состояние локального и системного гомеостаза организма [4]. С возрастом в БЭ человека наблюдается снижение экспрессии матриксных металлопротеиназ (ММР2, ММР9), CD90 и белка ERBB3, которое наиболее выражено у пожилых людей в сравнении с лицами среднего возраста. Полученные данные позволяют рассматривать БЭ как объект для прижизненной персонализированной оценки темпов старения организма (по снижению способности его клеток к дифференциации и ремоделированию межклеточного матрикса). Использование БЭ позволяет объективно оценить биологический возраст [5]. Анализ БЭ дает возможность изучить экспрессию сигнальных молекул, оценить электрокинетические характеристики клеток, поэтому обладает большой информативностью и может быть применим для ранней диагностики социально значимых заболеваний, воспалительных процессов и онкологических заболеваний, состояния локального иммунитета, а также для оценки влияния на организм неблагоприятных факторов окружающей среды [6].

Преимуществами использования БЭ являются неинвазивность, нетравматичность, легкость получения достаточного количества клеток, возможность оценки общего и местного действия факторов. Кроме этого, эпителиоциты слизистой оболочки ротовой полости обладают чувствительностью к различным экзогенным и эндогенным факторам, так как выполняют защитную функцию в организме. Следовательно, состояние БЭ является важным информативным показателем, использующимся для оценки состояния здоровья, диагностики соматической патологии, стрессорных воздействий, вредных факторов внешней среды. БЭ является частью мукозальной системы, поэтому сохраняет элементы ее активной позиции во взаимоотношениях со стимулами, исходящими из внешней и внутренней среды. Это позволяет использовать БЭ при изучении реактивности и физиологии слизистых оболочек, в том числе в качестве индикатора местных и общих нарушений гомеостаза [7].

Характер дестабилизационных процессов на местном и системном уровнях отражается состоянием клеток БЭ. Буккальные эпителиоциты могут быть индикатором нарушений орального гомеостаза [8]. Разработка новых методов своевременного выявления патологических состояний пародонта позволит заблаговременно начинать лечение и снизить количество возможных осложнений. В качестве такого своевременного метода диагностики возможно использовать измерение экспрессии сигнальных молекул в БЭ лиц пожилого и старческого возраста. Такая методика отличается простотой выполнения и информативностью, так как забор БЭ представляет собой простую процедуру, а его состояние является важным информативным показателем, использующемся при оценке состояния здоровья, и отражающим нарушения орального гомеостаза и наличие патологических процессов зубочелюстной системы.

Цель исследования: выявить молекулярно-клеточные механизмы дисфункции буккального эпителия у пациентов зрелого, пожилого и старческого возраста с хроническим генерализованным пародонтитом.

Материалы и методы исследования. В ходе эксперимента было обследовано 90 пациентов, страдающих хроническим генерализованным пародонтитом средней степени тяжести и обратившихся за помощью на кафедру пропедевтики и профилактики стоматологических заболеваний ГБОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России: 34 пациента среднего возраста (45-59 лет), 32 пациента пожилого возраста (60-74 года) и 24 пациента старческого возраста (75-89 лет), и 77 пациентов без признаков воспалительной патологии пародонта: 27 пациентов среднего возраста, 25 пациентов пожилого возраста и 20 пациентов старческого возраста. При постановке диагноза использовали классификацию болезней пародонта, принятую на XVI пленуме Всесоюзного научного общества стоматологов (1983) и одобренную на президиуме одонтологии Российской Академии стоматологии (2001).

Забор БЭ из ротовой полости (слизистая оболочка щеки) осуществляли либо натощак, либо не ранее чем через 4 часа после приема пищи. Непосредственно перед получением материала пациенты полоскали полость рта физиологическим раствором. Забор материала производили стерильными разовыми зондами с синтетическим ворсом. После получения исследуемого материала, отрезанную рабочую часть зонда помещали в стерильную одноразовую пробирку «Эппендорф», содержащую транспортную среду. Для приготовления цитологических мазков применяли два метода: метод стандартных цитологических мазков на предметных стеклах и метод жидкостной цитологии с использованием автоматизированной системы Novoprep <<NRS>> (Франция).

Иммунофлуоресцентную конфокальную микроскопию проводили на нефиксированных суспензиях клеток БЭ. Образцы помещали на покрытые поли-L-лизином предметные стекла (Sigma). Для иммунофлуоресцентного исследования использовали первичные антитела: к ингибитору циклинзависимой киназы 1A белок p21 (1:100, Dako), проапоптотическому белку p53 (1:50, Novocastra), ингибитору циклин-зависимой киназы 2A белку p16 (1:100, Novocastra). Для блокады эндогенной активности фермента при инкубации со щелочной фосфатазой набора добавлялся левамизол (1.25 mM). Изучение препаратов проводили в конфокальном микроскопе Olympus FluoView FV1000 при увеличении 200.

Методика визуализации экспрессии антител проводилась по следующей схеме: Трижды промывали PBS (по 5 мин). Пермеабилизовали клетки 0,1% Triton X-100 (Биолот, РФ (растворенном в PBS) в течение 15 мин. Промывали в трех сменах PBS (по 5 мин). Инкубировали в 1% бычьем сывороточном альбумине (Биолот, РФ) (разведенным PBS, pH 7.5) в течение 30 мин для блокировки неспецифического связывания. Инкубировали с первичными антителами 60 мин. Промывали в трех сменах PBS (трижды по 5 мин). Ядра клеток докрашивали DAPI в течение 1 мин (краситель использовался в качестве флуоресцентного маркера ДНК, при связывании с которой его флуоресценция усиливается). Промывали в PBS 5 мин. Готовые препараты заключали под покровные стекла в монтирующую среду Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako, США). Для анализа полученных результатов использовали конфокальный микроскоп Olympus FluoView 1000 (Япония).

Морфометрический анализ полученных изображений проводили в программе «Видеотест-Морфология 5.2». На каждом препарате исследовали 10 полей зрения при увеличении 200 [9]. Площадь экспрессии (%) рассчитывали как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади поля зрения. Указанный параметр отражает интенсивность синтеза или накопления исследуемых сигнальных молекул.

Статистическая обработка результатов выполнялась с использованием стандартного пакета программ прикладного статистического анализа (Statistica 7.0). Для оценки достоверности межгрупповых различий значений признаков применяли t-критерий Стьюдента при р<0.05.

Результаты и их обсуждение. В результате проведенных исследований выявлены достоверные различия в площади экспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы 2A p16 в БЭ у доноров с хроническим пародонтитом по сравнению со здоровыми пациентами во всех возрастных группах (рис. 1).

* - достоверность различий по сравнению со значениями показателя в группе здоровых доноров той же возрастной категории (p<0.05);

** - достоверность различий по сравнению со значениями показателя в группе больных среднего возраста (p<0.05);

х - достоверность различий по сравнению со значениями показателя в группе здоровых доноров среднего возраста (p<0.05)

* - significance of differences compared with the values of the indicator in the group of healthy donors of the same age category (p<0.05);

** - significance of differences compared with the values of the indicator in the group of patients with middle age (p<0.05);

x - significance of differences compared with the values of the indicator in the group of healthy donors of middle age (p<0.05)

Рис. 1. Возрастные особенности экспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы 2A белка p16 в БЭ в норме и при хроническом пародонтите

Fig. 1. Age specific features of the expression of inhibitor of cyclin-dependent kinase 2A of p16 protein in EB in normal and chronic periodontitis

Площадь экспрессии белка p16 у здоровых доноров среднего, пожилого и старческого возраста составила 0.37±0.05%, 0.79±0.06% и 1.93±0.11% соответственно. В группе доноров среднего возраста с хроническим пародонтитом экспрессия маркера p16 увеличилась в 4,3 раза (p<0.05) по сравнению со здоровыми пациентами этой возрастной группы. Установлено, что площадь экспрессии белка p16 в группе больных пожилого возраста увеличилась в 2.94 раза (p<0.05) по сравнению со здоровыми донорами пожилого возраста. В группе доноров старческого возраста с хроническим пародонтитом площадь экспрессии белка p16 увеличилась в 2.18 (p<0.05) раза по сравнению со здоровыми донорами этой возрастной группы.

Площадь экспрессии p16 у здоровых доноров пожилого и старческого возраста увеличилась в 2.14 (p<0.05) и 5.22 (p<0.05) раза соответственно по сравнению с этим показателем у здоровых лиц среднего возраста. Экспрессия p16 у больных пожилого возраста повысилась в 1.46 раза (p<0.05) по сравнению с этим показателем у больных среднего возраста. Площадь экспрессии p16 у лиц старческого возраста с хроническим пародонтитом возросла в 2.65 раза (p<0.05) по сравнению с этим показателем у больных среднего возраста.

В ходе эксперимента установлено, что площадь экспрессии ингибитора циклин-зависимой киназы 1A p21 в БЭ достоверно увеличивалась у доноров с хроническим пародонтитом по сравнению со здоровыми пациентами во всех возрастных группах (табл. 1).

Таблица 1

Площадь экспрессии белка p21 у здоровых доноров и больных хроническим пародонтитом в разных возрастных категориях

Table 1

Area of expression of p21 protein in healthy donors and patients with chronic periodontitis in different age categories

* - достоверность различий по сравнению со значениями показателя в группе здоровых доноров той же возрастной категории (p<0.05);

** - достоверность различий по сравнению со значениями показателя в группе больных среднего возраста (p<0.05)

* - significance of differences compared with the values of the indicator in the group of healthy donors of the same age category (p<0.05);

** - significance of differences compared with the values of the indicator in the group of patients with middle age (p<0.05)

Отмечено увеличение площади экспрессии белка p21 в группе больных среднего возраста в 3.96 раза (p<0.05) по сравнению со здоровыми донорами этой возрастной категории. Площадь экспрессии белка p21 у лиц пожилого возраста с хроническим пародонтитом увеличилась в 6.96 раз (p<0.05) по сравнению со здоровыми донорами этого возраста. В группе больных старческого возраста показатель повысился в 7.1 раза (p<0.05) по сравнению со здоровыми донорами старческого возраста.

У здоровых доноров не наблюдалось достоверных различий экспрессии белка p21 в БЭ между различными возрастными группами. Экспрессия p21 в БЭ лиц пожилого возраста с хроническим пародонтитом достоверно возросла в 1.69 раза (p<0.05) по сравнению с этим показателем у больных среднего возраста. У лиц старческого возраста с хроническим пародонтитом экспрессия p21 в БЭ увеличилась в 2.08 (p<0.05) раза по сравнению с больными среднего возраста.

Согласно полученным данным иммуноцитохимического исследования площадь экспрессии проапоптотического белка p53 в БЭ у доноров с хроническим пародонтитом достоверно увеличилась по сравнению со здоровыми пациентами во всех возрастных группах (рис. 2).

* - достоверность различий по сравнению со значениями показателя в группе здоровых доноров той же возрастной категории (p<0.05);

** - достоверность различий по сравнению со значениями показателя в группе больных среднего возраста (p<0.05);

х - достоверность различий по сравнению со значениями показателя в группе здоровых доноров среднего возраста (p<0.05)

* - significance of differences compared with the values of the indicator in the group of healthy donors of the same age category (p<0.05);

** - significance of differences compared with the values of the indicator in the group of patients with middle age (p<0.05);

x - significance of differences compared with the values of the indicator in the group of healthy donors of middle age (p<0.05)

Рис. 2. Возрастные особенности экспрессии проапоптотического белка p16 в БЭ в норме и при хроническом пародонтите

Fig. 2. Age features of pro-apoptotic protein expression of p16 in BE in norm and in chronic periodontitis

Площадь экспрессии p53 у здоровых доноров среднего, пожилого и старческого возраста составила 0.76±0.09%, 0.81±0.10% и 1.24±0.10% соответственно. Установлено, что в группе доноров среднего возраста с хроническим пародонтитом данный показатель увеличился в 4.39 раза (p<0.05) по сравнению со здоровыми донорами этой возрастной категории. В группе пожилых больных отмечено увеличение экспрессии p53 в 4,8 раза по сравнению со здоровыми пациентами этого возраста. У пациентов старческого возраста с хроническим пародонтитом площадь экспрессии p53 в БЭ возросла в 3.23 раза по сравнению со здоровыми донорами старческого возраста.

У здоровых доноров старческого возраста площадь экспрессии маркера p53 выросла в 1.63 раза (p<0.05) по сравнению с показателем в группе здоровых людей среднего возраста. Показатель площади экспрессии p53 в группе доноров пожилого возраста с хроническим пародонтитом возрос в 1.17 раза (p<0.05) по сравнению с больными среднего возраста. У лиц старческого возраста с пародонтитом площадь экспрессии белка p53 увеличилась в 1.2 раза (p<0.05) по сравнению с показателем у больных среднего возраста.

Белки р16, р21 и р53 являются маркерами каспаза-зависимого апопотоза и позволяют характеризовать процессы клеточного обновления БЭ. Белок р21 играет ключевую роль в остановке клеточного цикла после повреждения ДНК, его сверхэкспрессия ведет к аресту клеточного цикла в G1,G2 или S фазах [10]. Известно, что в быстро делящихся клетках, в том числе и в БЭ, было обнаружено увеличение концентрации белка р53 по сравнению с медленно пролиферирующими клетками [11]. Белок р16 играет ключевую роль в контроле клеточного цикла, блокируя сигнальный путь циклин-D-pRb и в механизмах клеточного старения [12]. Повышение экспрессии указанных белков при хроническом пародонтите, нарастающее с возрастом, указывает на преобладание гибли клеток БЭ и его ускоренного старения.

Таким образом, выявленное возрастное изменение экспрессии пула сигнальных молекул (р16, р21, р53) в БЭ у пациентов с хроническим пародонтитом может явиться основой для разработки нового метода определения эффективности лечения этой патологии и ее диагностики на ранних стадиях в зависимости от возраста пациента.

Выводы.

1. Экспрессия маркеров каспаз-зависимого апоптоза р16, р21, р53 в БЭ пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом среднего, пожилого и старческого возраста повышалась в 2-7 раз в зависимости от возраста по сравнению со здоровыми донорами.

2. У здоровых доноров при переходе от среднего к старческому возрасту экспрессия белка р16 возрастала в 4.5 раза, что указывает на наличие механизмов клеточного старения в буккальных эпителиоцитах.

3. Выявленное возрастное изменение экспрессии пула сигнальных молекул (р16, р21, р53) в БЭ у пациентов с хроническим пародонтитом может явиться основой для разработки нового метода определения эффективности лечения этой патологии и ее диагностики на ранних стадиях в зависимости от возраста пациента.

В отношении данной статьи не было зарегистрировано конфликта интересов.