Введение. Сахарный диабет, осложненный синдромом диабетической стопы (СДС), получил в последнее время значительную актуальность в высокоразвитых странах мира, о чем свидетельствует высокий уровень фатальных последствий, ампутаций нижних конечностей и место, которое занимает СДС среди сложных медико-социальных проблем, требующих для свеого решения значительных интеллектуальных, организационных и экономических ресурсов [1, 2].

Исследовательской группой ВОЗ по сахарному диабету в Женеве в 1987 году СДС впервые был отделен как самостоятельное заболевание. Данный синдром осложняет течение сахарного диабета у 4-25 % пациентов. При этом риск возникновения гангрены нижних конечностей у больных в 20 раз выше, чем в общей популяции. Практически каждую минуту в мире выполняется ампутация по поводу СДС. Процент послеоперационных осложнений у таких больных достигает 37, а послеоперационная летальность составляет 9-26% [3].

Идентификация генетических компонентов СД2 является наиболее важной частью исследований в изучении этой патологии, поскольку выявление генов-кандидатов развития диабета позволяет влиять на все усилия, направленные в сторону понимания патогенеза болезни, ее осложнений, диагностики, лечения и профилактики [4].

Как известно, в патогенезе СДС важную роль играет нарушение функций эндотелия. Считается, что одним из факторов наступления макро- и микроангиопатий при СДС может быть дисфункция сосудистого эндотелиального фактора роста А (VEGFA), который является мощным митогеном клеток эндотелия сосудов и протеином, что обеспечивает миграцию эндотелиоцитов, их инвазию в коллагеновый гель и образования новых сосудов. Кроме того VEGFА необходим не только для формирования нормальных сосудов, но и для их созревания и виживания [5]. Показано, что длительное снижение концентрации или блокада VEGFА приводит к ухудшению выживания эндотелиальных клеток, уменьшению в тканях терминальных артериол и капилляров, повышению артериального давления [6].

Ген VEGFA находится на коротком плече 6-й хромосомы (6p21.3) и состоит из 8 экзонов, разделенных 7 интронами [7]. На сегодня, по данным сайта ncbi (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term=VEGFA), в гене VEGFA насчитывается 4578 полиморфных сайтов. Одним из наиболее клинически значимых считается однонуклеотидный полиморфизм С936Т, находящийся в 3'-нетранслируемой области (3'UTR) указанного гена. В различных популяциях мира показано, что этот полиморфный локус ассоциирован с развитием СД2 и его осложнений [8, 9, 10]. При этом данных касательно связи этого однонуклеотидного полиморфизма с развитием СДС нет.

Цель данной работы стало изучение возможной связи С936Т-полиморфизма гена VEGF-A с развитием СДС у украинских пациентов с СД2.

Материалы и методы исследования. В работе была использована кровь 154 больных с сахарным диабетом 2-го типа (СД2), осложненного синдромом диабетической стопы (СДС), которые находились на стационарном лечении в КУ «Сумская городская клиническая больница №5» в отделениях сосудистой хирургии и отделении хирургии №3 в течение 2011-2013 годов. Диагноз СДС выставлялся на основании приказа МЗ Украины от 21.12.2012 № 1118 «Об утверждении и внедрении медико-технологических документов по стандартизации медицинской помощи при сахарном диабете 2 типа». Оценка состояния конечностей включала выявление язв или ампутации стопы в анамнезе, симптомов заболевания периферических артерий; выявление изменения цвета кожи на нижних конечностях; выявление деформаций стопы и осмотр обуви, выявление видимых признаков нейропатии, начальных стадий ишемии, деформации или поражения ногтей. Неврологический статус оценивался согласно оценке диабетической нейропатии. Определялись нарушения чувствительности стопы. Оценка состояния артериального кровотока включала пальпаторное определения его уровня и оценку симметричности пульсации на сосудах нижних конечностей. Недостаточность артериального кровотока нижних конечностей оценивалась по классификации Фонштейн-Лериша-Покровского. Из инструментальных методов исследования использовались дуплексное ультразвуковое сканирование артерий нижних конечностей, реовазография и ангиографическое исследования. Также проводилось бактериологическое исследование язвенного экссудата для определения микрофлоры и ее чувствительности к антибактериальным препаратам. Лабораторные исследования включали клинический анализ крови и мочи, определение глюкозы крови, гликемического профиля, гликозилированного гемоглобина.

Контрольная группа представлена ​​124 лицами без сахарного диабета и нарушений толерантности к глюкозе. Отсутствие других мультифакториальных болезней подтверждалась путем сбора анамнестических данных, снятия электрокардиограммы, измерения артериального давления, проведения биохимических исследований. Исследование проводилось с соблюдением основных положений Конвенции Совета Европы о правах человека и биомедицине, Хельсинский декларации Всемирной медицинской ассоциации об этических принципах проведения научных медицинских исследований с участием человека (1964, с последующими дополнениями, включая версию 2000) и Приказа МЗ Украины № 690 от 23.09.2009 г. Все пациенты перед забором венозной крови на генетический анализ подписали информированное согласие. Забор образцов крови для генотипирования проводили в стерильных условиях в S-моноветы объемом 2,7 мл (Sarstedt, Германия), содержащих калиевую соль EDTA в качестве антикоагулянта. Образцы замораживали и хранили при температуре -20 ºC.

ДНК для генотипирования выделяли из периферических лейкоцитов с помощью коммерчески доступных комплектов GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с протоколом производителя. Для определения полиморфизма С936Т (rs3025039) гена VEGFA была проведена полимеразная цепная реакция с последующим анализом длины рестрикционных фрагментов (PCR-RFLP). Участок гена VEGFA, содержащей нужный полиморфный локус, амплифицировали с помощью пары специфических праймеров: прямой (sense) – 5'-AAGGAAGAGGAGACTCTGCGCAGAGC-3' и обратный (antisense) – 5'-TAAATGTATGTATGTGGGTGGGTGTGTCTACAGG-3'. Праймеры были синтезированы фирмой Metabion (Германия). Для проведения ПЦР брали 50-100 нг ДНК и добавляли к смеси, содержащей 5 мкл 5-кратного ПЦР-буфера, 1,5 ммоль/л сульфата магния, 200 мкмоль/л смеси четырех нуклеотидтрифосфатив, по 15 пмоль/л каждого из праймеров и 1 ЕД Taq-полимеразы (ThermoFisher Scientific, США), объем доводили до 25 мкл деионизированной водой. ПЦР проводили в термоциклере GeneAmpPCR System 2700 (ThermoFisher Scientific, США). Амплификация состояла из 33 циклов: денатурация – 94 °С (50 c), гибридизация – 59 °С (60 с) и элонгация – 72 °С (60 с). Для рестрикционного анализа 6 мкл продукта амплификации (208 п.н.) инкубировали при 37° С в течение 18 ч с 5 ЕД рестриктазы Hin1II (NlaIII) (ThermoFisher Scientific, США). Если в +936-м положении 3'-нетранслируемой области (3'UTR) гена VEGFA находился цитозин, эндонуклеаза не находила сайта рестрикции и исходный фрагмент 208 п.н. оставался без изменений. В случае замены цитозина на тимин рестриктаза Hin1II расщепляла амплификат на два фрагмента – 122 п.н. и 86 п.н. Фрагменты рестрикции разделяли с помощью электрофореза в 2,0% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Визуализацию ДНК после электрофореза осуществляли с помощью трансиллюминатора («Биоком», Россия).

Статистический анализ проводили с использованием программы SPSS-17. Непрерывные данные показаны в виде среднего значения ± SD (стандартное отклонение), номинальные данные представлены в виде количественных и процентных значений. Проверку непрерывных данных на нормальность распределения осуществляли с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Для сравнения распределения генотипов в экспериментальной и контрольной группах а также соответствия этого распределения равновесию Харди-Вайнберга применяли χ²-критерий Пирсона. Для установления риска развития СДС рассчитывали отношение шансов (OR) и 95% доверительный интервал (CI) для доминантной, рецессивного, супердоминантной и аддитивной моделей наследования. Такие факторы риска СД2, как возраст, пол, ИМТ, курение, наличие ожирения и артериальной гипертензии (АГ) были применены в качестве ковариат во время мультивариабельного логистического регрессионного анализа. Все тесты были двусторонними, значения Р < 0,05 считали статистически значимыми.

Результаты и их обсуждение. Клиническая характеристика 154 пациентов с СДС и 124 лиц группы контроля представлена ​​в таблице 1. Не найдено значимой разницы между группами сравнения в показателях средних значений диастолического АД (Р = 0,109), а также в соотношении курильщиков (Р = 0,173), лиц с ИМТ > 25 кг/м² (Р = 0,060) и с АГ (Р = 0,121). При этом показатели ИМТ (Р = 0,007) и концентрации глюкозы крови (P < 0,001) у больных были существенно выше, чем в группе контроля (P < 0,001), а значение систолического АД (P <0,001), наоборот, было выше у пациентов без СДС. Также группы сравнения отличались по соотношению особей разного пола (Р = 0,038) и наличию лиц с ожирением (Р = 0,027). Кроме этого, отдельно следует указать, что средний возраст представителей контроля (76,6 ± 10,2 года) был существенно выше, чем у пациентов с СДС (P<0,001). Последнее обстоятельство увеличивало надежность контроля, поскольку уменьшалась вероятность развития СД2 и его соложнений у этих людей в будущем.

Таблица 1

Общая характеристика пациентов с синдромом диабетической стопы и лиц группы контроля

Table 1

General characteristics of patients with diabetic foot syndrome and control subjects

Примечание: n – количество пациентов, СДС – синдром диабетической стопы, ИМТ – индекс массы тела, АД сист. – систолическое артериальное давление, АД диаст. – диастолическое артериальное давление. Сравнение категориальных переменных реализовано с использованием χ²-теста, непрерывных переменных – t-теста.

Note: n – number of patients, СДС – diabetic foot syndrome, ИМТ – body mass index, АД сист. – systolic blood pressure, АД диаст. – diastolic blood pressure. Comparison of categorical variables is implemented using the χ2-test, continuous variables - t-test.

В таблице 2 представлены частоты основного (C) и минорного (T) аллелей и приведены распределение генотипов по С936Т-полиморфному сайту 3'UTR гена VEGFA у больных с СДС и представителей группы контроля. Показано, что частоты указанных генотипов в контрольной и опытной группах находились в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга (Р > 0,05). Сравнение частот трех возможных вариантов генотипов, образованных полиморфным локусом С936Т гена VEGFA, между пациентами с СДС и представителями группы контроля методом χ²-критерий Пирсона показало отсутствие значимой разницы (Р = 0,413).

Таблица 2

Частота аллелей и генотипов по С936Т-полиморфизму гена VEGFA в группах сравнения

Table 2

The frequency of VEGFA C936T alleles and genotypes in comparison groups

Примечание: n – количество пациентов; СДС – синдром диабетической стопы; χ² и P отражают отклонения в каждой группе от равновесия Харди-Вайнберга

Note: n – number of patients; СДС – diabetic foot syndrome; χ² and P reflect the deviations in each group from Hardy-Weinberg equilibrium

Результаты регрессионного анализа ассоциации генотипов по С936Т-полиморфизму гена VEGFA с развитием СДС в рамках доминантной, рецессивной, наддоминантной и аддитивной моделей наследования показаны в таблице 3. Применение бинарной логистической регрессии не выявило достоверной связи исследуемого локуса с развитием СДС в рамках ни одной из моделей (P > 0,05). После этого была использована мультивариабельная логистическая регрессия. Однако, и после поправки на возраст, пол, ИМТ, наличие ожирения, АГ и привычку курить значимой ассоциации различных генотипов по полиморфному локусу 3'UTR гена VEGFA с развитием СДС установить не удалось (P > 0,05).

Таблица 3

Анализ связи С936Т-полиморфизма гена VEGFA с СДС в рамках разных моделей наследования

Table 3

Analysis of association between VEGFA C936T polymorphism and DFS under different inheritance models

Примечание: 95% CI – 95% доверительный интервал; P_набл – наблюдаемое значение P (без поправки на ковариаты); OR_набл – наблюдаемое отношение шансов; P_попр – значение P после поправки на возраст, пол, привычку к курению, ИМТ, наличие ожирения и АГ; OR_попр – отношение шансов после поправки на ковариаты. 

^а Первая строка в аддитивной модели отражает сравнения C/T-генотипа с С/С-генотипом, вторая строка – сравнение Т/Т-генотипа с генотипом С/С.

Note: 95% CI – 95% confidence interval; P_набл – observed value of P (without correction for covariates); OR_набл – observed odds ratio; P_попр – P value after adjusting for age, gender, smoking habit, BMI, presence of obesity and hypertension; OR_попр – odds ratio after correction for covariates.

^а The first line in the additive model reflects comparisons of the C/T genotype with the C/C genotype, the second line shows the comparison of the T/T genotype with the C / C genotype.

Однонуклеотидный полиморфизм rs3025039 представляет собой замену цитозина на тимин в +936 положении 3'-нетранслируемой области гена VEGFA. Такая точечная замена может предотвращать присоединение транскрипционного фактора AP-4 (transcription factor activating enhancer binding protein 4), что, в свою очередь, может влиять на качественные и количественные характеристики будущей мРНК [11]. В соответствие этому, на сегодня показана связь 936Т-аллеля гена VEGFA со снижением уровня его экспрессии и плазмовой концентрации его белка [11, 12].

За последние годы выполнено ряд работ, посвященных изучению влияние rs3025039-полиморфизма гена VEGFA на развитием СД2 и его осложнений. Так, коллективом Sellami et al. показана связь этого локуса с развитием и длительностью течения СД2 среди населения Туниса [9]. Группой российских авторов Klimontov et al. установлена связь С936Т-сайта с концентрацией VEGFA в плазме крови и развитием ишемической болезни сердца у пациентов с СД2 [8]. А результаты недавнего мета-анализа, выполненого Han et al., продемонстрировали сильную связь С936Т-полиморфизма гена VEGFA с риском развития диабетической ретинопатии среди населения Китая [10].

В нашей работе впервые был проведен анализ связи С936Т-полиморфного сайта гена VEGFA с риском развития СДС среди украинских пациентов с СД2. Сравнение частот генотипов по указанному локусу между пациентами экспериментальной и контрольной групп, а также регрессионный анализ без и с поправкой на различные факторы риска сахарного диабета не позволили установить связи полиморфного сайта С936Т гена VEGFA с развитием СДС в украинской популяции.

Однако, работами нескольких коллективов на сегодня уже доказана связь других полиморфных локусов гена VEGFA с развитием СДС. Группой Xiaolei et al. продемонстрирована протективная роль rs699947-локуса гена VEGFA относительно развития СДС у китайских пациентов [13]. Подобный защитный эффект касательно развития СДС, а также связь с содержанием белка в плазме крови был выявлен Li et al. для полиморфного сайта G-634C гена VEGFA [14]. А среди населения Ирана связь с риском развития СДС была установлена для полиморфизма С-2578A промотора гена VEGFA [15].

Следует отметить, что существенным ограничением нашего исследования является относительно небольшое количество пациентов, включенных в группы сравнения. Таким образом, возможная ассоциация между С936Т-сайтом и риском развития СДС могла быть упущена из-за небольшой статистической мощности. Другим ограничением является исследование связи только между полиморфным локусом и фенотипом без оценки их влияния на содержание мРНК VEGFA и концентрацию его белка в плазме крови. Таким образом, дальнейшие исследования с участием большего числа пациентов а также исследования функциональных эффектов С936Т-полиморфизма необходимы, чтобы сделать окончательный вывод о его роли в развитии СД2 и его хронических осложнений.

Заключение. Таким образом, результаты проведенного исследования показали, что у представителей украинской популяции отсутствует связь между полиморфизмом С936Т гена VEGFA и развитием СДС. Как до, так и после поправки на возраст, пол, привычку курения, индекс массы тела, наличие ожирения и артериальной гипертензией ни один из генотипов не был ассоциирован с риском развития СДС у пациентов с СД2.

В отношении данной статьи не было зарегистрировано конфликта интересов.