Введение. Патологические изменения ретинальных сосудов ведут к формированию ретинальной ишемии, что, в свою очередь, приводит к развитию ретинопатии, слепоте и инвалидности по зрению [1]. Примерно 100 миллионов людей в мире страдают ишемическими изменениями в сетчатке [2, 3, 4]. Рост заболеваемости гипертонической болезнью, атеросклерозом приводят к увеличению ишемических повреждений сетчатки. Ишемия сетчатки возникает в 35 % случаев у пациентов с атеросклеротическими изменениями сердечно-сосудистой системы, в 25 % случаев – у пациентов с гипертонической болезнью [5, 6]. Ишемия формируется на фоне нехватки кислорода, приводящей к угнетению метаболических процессов в тканях глаза с апоптозом нейронов сетчатки [7]. Ишемическая нейропатия является глазным симптомом различных системных заболеваний. Патология сосудистой системы глаза является одной из ведущих причин слабовидения и слепоты у различных возрастных групп населения [8].

Существует тесная взаимосвязь между поражением различных звеньев системы кровообращения и механизмом развития ишемии. В основе ишемии лежат как общие ангиоспастические заболевания, так и острая ишемия заднего отрезка глаза, проявляющаяся нарушениями кровообращения центральной артерии сетчатки, центральной вены сетчатки, нейропатии [9]. Клиническая картина характеризуется внезапным и стойким снижением визуса, дефектами в поле зрения, слепотой. Прогноз всегда серьезный, но не безнадежный. Под влиянием лечения может наступить улучшение или стабилизация процесса. Часто требуются повторные курсы лечения.

В настоящее время нет эффективного метода терапии ишемической нейропатии, несмотря на то, что она является ведущей патологией в системе заболеваний зрительного нерва и приводит к потере остроты зрения [10].

Коррекцию ишемических-реперфузионных повреждений сетчатки возможно проводить с применением агонистов имидазолиновых рецепторов [11], поэтому актуальным явилось изучение возможностей коррекции ишемии сетчатки новым представителем лигандов имидазолиновых рецепторов I, II типа с более высокой биодоступностью – калиевой солью С7070.

Цель исследования: повышение эффективности фармакологической коррекции ишемических-реперфузионных повреждений сетчатки с применением агонистов имидазолиновых рецепторов I, II типов.

Материалы и методы исследования. В экспериментах участвовало 50 крыс линии Wistar, самцов и самок, массой 225-275 г. В каждой группе было по 10 крыс. Первая группа – интактные животные, вторая – модель ишемии-реперфузии (контроль), третья – с коррекцией патологии субстанцией С7070 в дозе 10 мг/кг, четвертая – с коррекцией С7070 в дозе 50 мг/кг, пятая – с коррекцией калиевой солью С7070 в дозе 10 мг/кг. Все манипуляции и операции на животных проводились в условиях общего обезболивания путем внутрибрюшинного введения раствора хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг массы крысы.

Моделирование ишемии-реперфузии проводили путем однократного повышения внутриглазного давления (ВГД) до 110 мм.рт.ст. в течение 30 мин [5, 12, 13, 14].

В третьей группе вводили субстанцию С7070 интрагастрально через зонд однократно в дозе 10 мг/кг за 60 мин до повышения ВГД.

 В четвертой группе за 60 мин до повышения ВГД вводили субстанцию С7070 интрагастрально однократно в дозе 50 мг/кг [11].

Калиевую соль С7070 в дозе 10 мг/кг вводили интрагастрально через зонд за 60 мин до ишемии.

Через 72 часа реперфузии производили полное извлечение глазного яблока с прилежащими структурами для гистологического исследования и фиксировали иммерсионным способом в 10% растворе формалина [15]. После фиксации глазное яблоко строго через центр разрезали в меридианном направлении на две части и обе половины заливали по стандартной методике в парафин. Серийные срезы 5-7 мкм толщиной изготавливали в меридианном направлении, которые окрашивали гематоксилином и эозином. Гистологическая обработка на всех этапах выполнена с использованием оборудования фирмы «Leica» (Германия). Готовые препараты для микроскопического исследования и архивирования сканировали с помощью компьютерной системы архивирования и анализа изображений “Mirax Desk”. Анализ изображений выполнены с помощью программы  «Pannoramic Viewer» 1.15.4.

Результаты и их обсуждение. В эксперименте с введением С7070 в дозах 10 мг/кг и 50 мг/кг, калиевой соли С7070 в дозе 10 мг/кг выявлены морфометрические изменения в толщине слоев сетчатки, которые свидетельствуют о различной степени коррекции повреждений при ишемии-реперфузии.

Гистологическая структура сетчатки крыс линии Wistar из группы интактных животных представлена на рисунке 1.

Сетчатка представлена четко упорядоченной структурой с хорошо дифференцируемыми основными слоями, которые образованы перикарионами нейронов (ядерные и ганглионарный слои) и их отростками (сетчатые слои и слой нервных волокон). Фоторецепторный слой в норме относительно однородный, характеризуется слабо выраженным радиальным рисунком. Ядерные слои образованы плотно расположенными ядрами со средней интенсивностью базофильной окраски. Сетчатые слои и слой нервных волокон имеют мелкозернистый вид, гомогенную эозинофильную окраску. Ганглионарный слой образован среднего и крупного размера нейронами с крупными эухроматиновой структуры ядрами.

Рис. 1. Гистологическая структура сетчатки крысы интактной группы. Окр.  гематоксилином и эозином. Микрофото. х200

Fig.1. Histological structure of the retina in a rat from the intact group. Stained with haematoxylin and eosin. Microphoto. x200

Результаты гистологического исследования подтвердили формирование ишемии через 72 ч реперфузии в сетчатке в группе с моделированием патологии (рис. 2).

Рис. 2. Морфология сетчатки крыс с экспериментальной ретинальной ишемией-реперфузией. Выраженные дегенеративные изменения через 72 часа реперфузии. Дилатация вен и венул на уровне хориоидеи (стрелка). Структурные изменения сетчатки в виде отечных изменений и разрыхления внутреннего ядерного слоя (двойная стрелка). Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. х200

Fig. 2. Retinal morphology of rats with experimental retinal ischemia-reperfusion. Pronounced degenerative changes after 72 hours of reperfusion. Dilation of veins and venules at the level of the choroidal (arrow). Structural retinal changes in the form of edematous changes and loosening of the inner nuclear layer (double arrow). Stained with haematoxylin and eosin. Microphoto. x200

В группе с моделью патологии у всех животных выявлены выраженные морфологические изменения нейронов. В слое фоторецепторов выявлена структурная дискомплексация. Слой терял радиальную исчерченность, создаваемую за счет компактного расположения отростков нейронов, принимал разрыхленный вид. Присутствуют признаки деструкции дендритов по типу глыбчатого распада. В ядерных слоях сетчатки наблюдались сходные изменения в виде декомпактизации расположения ядер, формирования спонгиоформных пустот.

Морфология сетчатки крыс с коррекцией ишемии-реперфузии С7070 в дозе 10 мг/кг представлена на рисунке 3 А.

Результаты гистологических исследований подтвердили наличие выраженных протективных свойств у С7070 в дозе 50 мг/кг на модели ишемии-реперфузии сетчатки. Наблюдаемая картина почти не отличается от нормы и представлена на рисунке 3 Б.

Рис.3. А – Морфология сетчатки крыс с коррекцией ретинальной ишемии-реперфузии С7070 в дозе 10 мг/кг. Выраженные отечные изменения во внутреннем ядерном и наружном ядерном слоях. Дискомплексация структуры фоторецепторного слоя. Перинейрональный отек в ганглионарном слое. Б – Морфология сетчатки крысы с коррекцией ретинальной ишемии-реперфузии С7070 в дозе 50 мг/кг. Сохранность структуры слоев. Редкие отечные изменения во внутреннем ядерном слое. Небольшой перинейрональный отек в ганглионарном слое. Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. х200

Fig. 3. А – Retinal morphology of rats with retinal ischemia-reperfusion correction with C7070 at a dose of 10 mg/kg. Pronounced edematous changes in the inner nuclear and outer nuclear layers. Structure discomplexation of the photoreceptor layer. Perineural edema in the ganglionic layer. B – Retinal morphology of rats with retinal ischemia-reperfusion correction with C7070 at a dose of 50 mg/kg. Preservation of the layers structure. Rare edematous changes in the inner nuclear layer. Slight perineural edema in the ganglion layer. Stained with haematoxylin and eosin. Microphoto. x200

В группе с введением калиевой соли С7070 в меньшей степени были выражены повреждения в фоторецепторном слое и проявлялись в виде умеренной гомогенизации за счет более плотного расположения дендритов фоторецепторных нейронов. Незначительные изменения были в наружном ядерном слое: во-первых, качественные свето-микроскопические признаки нейрональных потерь в виде пикноморфных изменений нейронов, разрежения слоя с расширением межклеточных пространств (рис. 4), во-вторых, уменьшение плотности клеточного состава сопровождалось изменениями дистрофического и отечного типов в виде спонгиоза и вакуолизации межклеточных пространств, количественным отражением чего служит увеличение толщины слоя (рис. 5). При этом наружный сетчатый и внутренний ядерный слои оказались наименее измененными.

Рис .4. Изменения в наружном ядерном слое в группе с введением калиевой соли С7070 (умеренные пикноморфные изменения нейронов, расширение межклеточных пространств). Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. х400

Fig. 4. Changes in the outer nuclear layer in the group with the injection of potassium salt C7070 (moderate pycnomorphic changes of neurons, expansion of intercellular spaces). Stained with haematoxylin and eosin. Microphoto. x400

Сравнительная картина структуры сетчатки в группах с введением С7070 в дозе 50 мг/кг и калиевой соли С7070 в дозе 10 мг/кг представлена на рисунке 5.

Примечания: ФР – слой фоторецепторов; НЯ – наружный ядерный слой; НС – наружный сетчатый слой; ВЯ – внутренний ядерный слой; ВС – внутренний сетчатый слой; ГС – ганглионарный слой

Notes: ФР – a layer of photoreceptors; НЯ – the outer nuclear layer; НС – the outer mesh layer; ВЯ – inner nuclear layer; ВС – the inner mesh layer; ГС – ganglion layer

Рис.5. Сравнительная картина структуры сетчатки крыс при коррекции ретинальной ишемии-реперфузии субстанцией С7070 в дозе 50 мг/кг (А) и калиевой солью С7070 в дозе 10 мг/кг (Б). Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото. х200

Fig. 5.  A comparative picture of the retinal structure of rats in the correction of retinal ischemia-reperfusion with substance С7070 at a dose of 50 mg/kg (A) and potassium salt С7070 at a dose of 10 mg/kg (B). Stained with haematoxylin and eosin. Microphoto. x200

Результаты морфометрии слоев сетчатки в экспериментальных группах представлены в таблице 1.

Таблица 1

Влияние С7070 в дозах 10 мг/кг, 50мг/кг, калиевой соли С7070 в дозе 10 мг/кг на толщину слоев сетчатки через 72 ч реперфузии при коррекции ретинальной ишемии-реперфузии (М±m; n=10), мкм

Table 1

Effect of C7070 at doses of 10 mg/kg, 50 mg/kg, potassium salt C7070 at a dose of 10 mg/kg on the thickness of retinal layers after 72 hours of reperfusion in the correction of retinal ischemia-reperfusion (M±m; n=10), microns

Примечание: * – p<0,05 в сравнении с интактными; y – р<0,05 в сравнении с ишемией-реперфузией сетчатки.

Note: * – p<0.05 compared to intact rats; y – p<0.05 compared to retinal ischemia-reperfusion.

При моделировании патологии толщина фоторецепторного слоя уменьшается на 30,4%, внутреннего ядерного – на 22,7%, ганглионарного и нервных волокон - увеличивается на 19,7% по сравнению с нормой (p<0,05). Увеличение толщины нервных волокон ганглионарного слоя и наблюдается за счет формирования отека.

На фоне коррекции С7070 в дозе 10 мг/кг толщина фоторецепторного слоя больше на 10,9% (p>0,05) по сравнению со значением в группе с патологией и достоверно не отличается от него; толщина внутреннего ядерного слоя на 21,6% больше, чем в группе с патологией (p<0,05); толщина ганглионарного слоя и нервных волокон достоверно не отличается от значения в группе с моделью патологии.

На фоне коррекции С7070 в дозе 50 мг/кг и калиевой солью С7070 толщина фоторецепторного слоя, внутреннего ядерного слоя, ганглионарного слоя и нервных волокон достоверно не отличаются от соответствующих значений нормы.

Таким образом, при гистологическом и морфометрическом исследовании сетчаток крыс в экспериментальных группах с коррекцией ретинальной ишемии-реперфузии выявлено наиболее выраженное протективное действие у калиевой соли С7070 в дозе 10 мг/кг и С7070 в дозе 50 мг/кг, заключающееся в сохранении структуры ядерных слоев и слоя фоторецепторов, уменьшении ишемических повреждений в сетчатке, которые отмечались в группе с моделью ишемии-реперфузии.

 Результаты исследования позволяют обосновать новые перспективные направления поиска и создания эффективных лекарственных препаратов для специфической коррекции ишемических повреждений сетчатки. В перспективе применения агонистов имидазолиновых рецепторов I, II типов можно отметить их терапевтический потенциал в качестве нейропротектора.

Имидазолиновые рецепторы II типа обнаружены в головном мозге, и лиганды этих рецепторов могут проявлять нейропротекторные эффекты [16, 17]. Имидазолиновые рецепторы II типа – новая биомишень для коррекции неврологических патологий [18]. Активация имидазолиновых рецепторов приводит к ингибированию Na+/H+ ионообменных каналов [19]. Опубликованы экспериментальные данные о нейропротекторной активности ингибиторов Na+/H+ ионообменных каналов 1 изоформы NHE-1. NHE-1 широко экспрессируются во всех изученных типах нейронов, эпителиальных клетках сосудистой оболочки, глиальных клетках [20].

В клинических рекомендациях по лечению ишемической нейропатии не указаны средства для направленной, специфической коррекции ишемических повреждений сетчатки [21]. Коррекция ишемических повреждений осуществляется за счет раскрытия резервных капилляров, расширения сосудов, развития коллатерального кровообращения [22]. В связи вышеизложенным, является перспективным изучение возможностей фармакологической коррекции, а именно нейропротекции, морфофункциональных повреждений сетчатки на моделях in vitro и in vivo.

Заключение. В эксперименте выявлено, что калиевая соль С7070 в дозе 10 мг/кг обладает ретинопротективным действием на модели ишемии-реперфузии сетчатки, заключающимся в сохранении структуры ядерных слоев сетчатки и слоя фоторецепторов, уменьшении ишемических повреждений сетчатки.

В отношении данной статьи не было зарегистрировано конфликта интересов.