Введение. Чернушка дамасская (Nigelladamascena L., Ranunculaceae (Лютиковые)) – однолетнее травянистое растение высотой 15-40 см. Растение голое, с прямым, иногда слегка фиолетовым стеблем, с листьями дважды, трижды рассеченными на щетинистые сегменты. Верхние листья образуют покрывало, превышающее по длине цветок. Чашелистики продолговатые, с широкой ножкой [1]. Экстракт жирного масла из семян чернушки дамасской издавна широко применялся в народной медицине Ближнего Востока, Азии, Африки в качестве имуномодулирующего, анальгетического, противодисбиотического, антигистаминного и дерматотропного средства [2]. Установлено, что компонентный состав экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской представлен полиненасыщенными жирными кислотами (олеиновая, эйкозадиеновая, эйкозановая), аминокислотами, органическими кислотами (миристиновая кислота, бензойная кислота), а также токоферолами, β-ситостерином и тимохиноном, представляющего наибольшую биологическую ценность [3].

Тимохинон – 2-изопропил-5-метил-1,4-бензохинон (рис.1), является замещенным производным хинона, состоящего из сопряженной системы диона и бензольного кольца с метильным и изопропильным радикалами в боковой цепи.

Тимохинон фармакологически активный фитокомпонент, имеющий структурное сходство с коэнзимом Q митохондриальной дыхательной цепи. Подобная гомологичность строения обуславливает высокую антиоксидантную активность тимохинона [4]. Также для тимохинона установлены регулирующие свойства в отношении ферментов эндогенной антиоксидантной защиты: супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпреоксидазы, глутатион-S-трансферазы, НАДФ-оксидаз [5]. Известны иммуномодулирующие, гипогикемически[6], антинеопластические [7], противовоспалительные [8] свойства тимохинона. Также тимохинон характеризуется низкой системной токсичностью применения [9]. Вышеперечисленные виды фармакологической активности делают тимохинон, а соответственно и экстракт жирного масла из семян чернушки дамасской, в котором содержание тимохинона может достигать 24% перспективным средством вариантного фармакологического действия [10].

Цель исследования. В эксперименте изучить адатогенную активность и токсикологическую безопасность экстракта жирного масла семян чернушки дамасской.

Материалы и методы исследования.

Экспериментальные животные и их содержание

Экспериментальная часть данной работы была выполнена в лаборатории доклинических исследований Центра доклинических и клинических исследований НИУ «БелГУ». В качестве биологической модели в работе использовали: 36 мышей-самцов линии Balb/c; 234 аутбредных половозрелых крыс-самцов линии «Wistar», 4 морские свинки и 12 куриных эмбрионов. Все экспериментальные исследования были одобрены Этическим комитетом ФГАОУ ВО «Белгородского государственного национального исследовательского университета» (НИУ «БелГУ»). Содержание и все проводимые с животными манипуляции соответствовали общепринятым этическим нормам лабораторной практики («European Convention for the Protection of Vertebral Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. CETS No.123»).

Исследуемая субстанция, референтные препараты. Дизайн исследования.

В качестве изучаемой субстанции в работе выступал Экстракт жирного масла из семян чернушки дамасской 25 мл («SEZAM» г. Ташкент, респ. Узбекистан). На различных этапах экспериментальной работы препаратами сравнения служили: Облепиховое масло жидкое 25 мл (ООО НПФ «Алтайский букет», г. Барнаул, Россия); Элеутерококка экстракт жидкий 50 мл (ОАО «Дальхимфарм», г. Хабаровск, Россия). Дизайн исследования представлен в таблице 1.

Оценка раздражающего действия  (НЕТ – САМ test)

Оценку раздражающего действия экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской проводили на хорион-аллантоисной оболочке куриного эмбриона – НЕТ – САМ test. Вещества тестировали в 5 сериях (5 – опыт, 5-контроль) [11].

Оценка местно-раздражаюшего действия (DRAIZE-test)

Исследования по изучению раздражающего действия экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской было проведено по схеме Spielmann (Spielmann и соавт., 1996), in vivo на слизистой оболочке глаза морских свинок, n=4. Выраженность отека и гиперемии определяли по 5-ти бальной шкале (П. Михайлов, 1985). Оценка раздражения складывалась из суммы балла гиперемии и балла отека [12].

Оценка острой токсичности

Определение острой токсичности проводили согласно Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств под ред. А.Н. Миронова 2012 г. Изучаемый экстракт жирного масла из семян чернушки дамасской вводили через внутрижелудочный зонд дробно 3 раза через каждые 4 часа. [11]

Оценка нейротоксичности в актиметрическом тестировании

Для оценки нейротоксичности исследуемого объекта был использован тест актиметрии с инфракрасным мониторированием активности IR Actimeter (Panlab, Harvardapparatus). Фиксировались показатели локомоторной активности, стереотипных движений, груминга, вертикальной активности и общий уровень активности.

Экспериментальная модель острого стресса

Острый стресс моделировали путем иммобилизации крыс самцов на спине в условиях антиортостаза и затемнения в течение 6 часов. Через 24 часа после однократного введения и 14 дней после курсового, животных подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации под легким эфирным наркозом, вскрывали брюшную полость, извлекали желудок, надпочечники и тимус [13].

Для унификации данных высчитывали коэффициент протективного эффекта (КПЭ) препарата при каждом виде повреждающего воздействия и средний КПЭ (Сидоров А.В., 2004)

 (для стресса);

где:

О – показатели группы, получающей исследуемый препарат;

К – показатели контрольной группы (масло);

И – показатели интактной группы (животные не получали ни плацебо, ни препарат, воздействию стресса не подвергались).

Оценка актопротекторной активности

Актопротекторную активность экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской на определяли на модели принудительного плавания крыс с грузом 7,5% от массы тела при температуре воды 33-35ºС до полного утомления [14] и в тесте «Вращающийся стержень» [15].

Оценка антигипоксической активности

Нормобарическая и нормокапническая гипоксия моделировалась помещением крыс в гермокамеру объемом 1,5 литра. Углекислый газ удалялся натронной известью. Показателем сопротивляемости животных к воздействию гипоксии являлась продолжительность их жизни в минутах [16].

Оценка уровнягистамина и серотонина

Определение содержания гистамина и серотонина проводилось методом, основанном на измерении флюоресценции продуктов конденсации гистамина с ортофталевым альдегидом, а серотонина с нингидрином. Содержание гистамина и серотонина в крови и тканях выражалось в мкг/мл и мкг/г [16].

Оценка уровня 11-оксикортикостероидов

Для определения уровня 11-оксикортикостероидов в плазме крови крыс применялась методика Ю.А. Панкова и И.Я. Усватовой, которая основана на том, что экстрагированные из плазмы крови 11-ОКС обнаруживают флюоресценцию после обработки проб смесью концентрированной серной кислоты и этилового спирта [16].

Статистический анализ

Статистическую обработку опытов проводили с использованием t-критерия Стьюдента для независимых рядов с учетом поправки Бонферрони. Изменение исследуемых показателей считали статистически значимыми при p<0,05. Результаты опытов параметрически сравнивали с исходными показателями, с раствором физиологическим натрия хлорида и с зарегистрированными препаратами. Расчёты результатов проводились в пакете компьютерной программы Microsoft Excel Ver 9, 2000.

Результаты и их обсуждение.

Определение безопасности применения и экспериментальной дозы  экстракта жирного масла чернушки дамасской

Оценку раздражающего действия HET-СAM test проводили на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона. Исследуемое жирное масло наносили на хориоаллантоисную оболочку в дозе 0,3 мл и наблюдали в течение 120 секунд: оболочка была, не нарушенная прозрачная тонкая с нормально функционирующей сетью кровеносных сосудов и капилляров.  Следующий этап это местно-раздражающее действие в DRAIZE-test, его проводили на морских свинках в течение 2 минут. В качестве контроля (растворитель) в тестах выступало подсолнечное масло ГОСТ Р 52465 – 2005. Согласно полученным результатам двух экспериментов жирное масло чернушки дамасской имеет слабое раздражающее действие (табл. 2, 3).

В результате проведенной оценки острой токсичности (табл.4) экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской установлено, что исследуемый объект по классификации Hodge и Sterner, а также по классификации К.К. Сидорова относится к 5 классу токсичности соединений, т.е. практически не токсичным веществам (LD₅₀ крысы > 68 мл/кг, и LD₅₀ мыши > 62,5 мл/кг)

Кроме того, на основании данных актиметического тестирования можно предположить отсутствие у ЭЖМЧД токсического влияния на ЦНС экспериментальных животных (рис. 2). Введение ЭЖМЧД несколько увеличивало поисковую активность и снижало проявление психомоционального дефицита, о чем свидетельствует увеличение общей двигательной активности (10,2%) и уменьшение стереотипных движений (88,9%) и груминга (80%) соответственно.

Оценка зависимости «доза-эффект» экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской

Эффективную дозу экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской для дальнейшего исследования определяли на основании результатов, полученных при оценке влияния различных доз изучаемого объекта на уровень физической работоспособности экспериментальных животных в тесте «принудительное плавание с отягощением». Эксперимент поставлен на 42 крысах-самцах, предварительно рандомизированных по продолжительности плавания и массе, случайным образом распределенных на 6 равных экспериментальных групп. Изучаемый экстракт жирного масла из семян чернушки дамасской вводили в следующем диапазоне доз: 1/100 LD₅₀; 1/50 LD₅₀; 1/30 LD₅₀; 1/20 LD₅₀; 1/10 LD₅₀; 1/5 LD₅₀ (поскольку при оценке острой токсичности экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской гибели животных отмечено не было, за величину LD₅₀  принимали максимально введенный объем – для крыс 68 мл/кг).

В результате проведенного исследования было установлено, что однократное интрагастральное введение ЭЖМЧД в указанном диапазоне доз способствовало повышению физической активности экспериментальных животных по отношению к контрольной группе крыс. При этом увеличение работоспособности при введении ЭЖМЧД в дозе 1/100 LD₅₀ не привело в статистически значимому повышению физической активности животных по сравнению с контрольной группой крыс (но была отмечена положительная тенденция изменений), в то время как на фоне введения изучаемого объекта в дозах 1/50 LD₅₀ и 1/30 LD₅₀ рост физической работоспособности крыс по отношению к группе контроля составил + 63% (p<0,05) и +173,9% (p<0,05) соответственно. Дальнейшее увеличение вводимой дозы экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской значимого влияния на уровень физической активности экспериментальных животных не оказало (табл. 5).

Таким образом, для проведения дальнейших исследований были выбраны дозы ЭЖМЧД 1/100 LD₅₀ и 1/30 LD₅₀ , что эквивалентно 0,7 мл/кг и 2,3 мл/кг.

Таким образом, эффективной дозой изучаемого экстракта можно считать дозу в 2,3 мл/кг.

Изучение адаптогенной, актопротекторной и противострессорной активности экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской

Влияние экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской на переносимость острого стресса

Переносимость к стрессу определялась с учетом следующих показателей: весовой коэффициент надпочечников, весовой коэффициент тимуса и степень изъязвления слизистой оболочки желудка и величины КПЭ.

Результаты исследования представлены в таблице 6.

Полученные данные показывают, что экстракт жирного масла чернушки дамасской в дозе 2,3 мл/кг активно препятствует стрессорной инволюции тимуса, гипертрофированности надпочечников и способствует снижению эрозивно-язвенного поражения слизистой оболочки желудка. При этом наиболее выраженный стрессопротекторный эффект отмечен при введении ЭЖМЧД в дозе 2,3 мл/кг, что послужило основанием для оценки влияния ЭЖМЧД в данной дозе на гормонально-медиаторный обмен у крыс на фоне острого стресса.

В  ходе данного блока экспериментальной работы установлено, что введение экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской 2,3 мл/кг животным однократно (за 40 мин до иммобилизации) и в течение 14 дней до начала эксперимента способствовало нормализации уровня катехоламинов во всех изучаемых тканях (табл. 7). Причем, фармакологический эффект исследуемого экстракта, становился более выраженным при его курсовом применении.

Таблица 7

Влияние экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской в дозе 2,3 мл/кг на обмен катехоламинов у крыс на фоне острого стресса

Table 7

The effect of the extract of fatty oil from the seeds of Nigella damascena L. at a dose of 2.3 ml/kg on the metabolism of catecholamines in rats against acute stress

При этом следует отметить, что введение ЭЖМЧД значимого влияние на изменение гормонально-медиаторного обмена у животных без патологии не оказало.

Также применение ЭЖМЧД в условиях стресса у животных способствовало  снижению концентрации серотонина в крови при однократном и курсовом применении соответственно на 36,77% (р<0,05) и 44,15% (р<0,01) относительно контроля. На фоне введения экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской в дозе 2,3 мл/кг практически нормализовалась концентрация гистамина в плазме крови стрессированных крыс. Нормализация обмена серотонина и гистамина у животных, подвергшихся стрессу, при применении ЭЖЧД отмечена также в миокарде и головном мозге. Кроме того экстракт жирного масла из семян чернушки дамасской 2,3 мл/кг, как при однократном, так и при курсовом применении снижал уровень 11-ОКС в крови на 23,19% и 46,57% (р<0,05) соответственно.

Адаптогенная активность экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской в дозе 2,3 мл/кг

По литературным данным адаптогены должны повышать сопротивляемость организма к действию  стрессирующих факторов экзогенного и эндогенного происхождения. При этом должны обладать, сочетанным антигипоксическим, актопротекторным и стресспротектторным эффектом.

Применение исследуемого ЭЖМЧД увеличивало продолжительность жизни животных в условиях гипоксии, как при однократном, так и при курсовом применении по сравнению с группой контроля. Достоверные данные (р<0,05) были получены для экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской в дозе 2,3 мл/кг (таб.8). Также введение (однократно и курсом) крысам  ЭЖМЧД в данной дозе способствовало  увеличению работоспособности животных в тесте «принудительное плавание» (в 2,357 раза (p<0,05) и в 3,179 (p<0,05) раза соответственно).

Кроме того, применение ЭЖМЧД способствовало увеличению работоспособности животных в тесте «Вращающийся стержень» (табл.9) на 230% при однократном введении и на 263% при курсовом введении соответственно.

Согласно литературным данным и результатам экспериментальных и клинических исследований, средства адаптогенного действия должны сочетать безопасность и большую широту терапевтического действия с одной стороны и высокую фармакологическую активность [17], выражаемую в повышении сопротивляемости организма к большому количеству стрессирующих факторов экзогенного и эндогенного происхождения (физической, химической и биологической природы) с другой [18]. При этом данные препараты должны обладать сочетанием антигипоксического, актопротекторного и стресспротекторного эффектов [19]. Причем, по степени выраженности этих эффектов можно довольно точно судить об адаптогенном потенциале субстанции. Кроме того, действие адаптогенных средств должно проявляться только на соответствующем патологическом фоне, вызывая при этом минимальные сдвиги гомеостаза [20]. Вышеперечисленные требования стали основанием для проведения нами комплекса экспериментов, позволяющих оценить влияние экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской на устойчивость животных к экстремальным условиям.

Оценка антигипоксических свойств экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской показала, что в условиях нормобарической нормокапнической гипоксии исследуемый объект в дозе 2,3 мл/кг достоверно увеличивал (по отношению к животным без фармакологической поддержки) продолжительность жизни животных в условиях кислородного голодания на 35% после однократного введения субстанции и на 26% при курсовом применении экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской.

Проведенные оценка актопротекторной активности показала, что однократное введение исследуемого экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской в дозе 2,3 мл/кг достоверно повышало работоспособность крыс в 2 раза по сравнению с группой контроля (без фармакологического вмешательства), а при курсовом применении изучаемого объекта продолжительность плавания животных достоверно превышало показатели контроля в 3 раза. Также введение экстракта жирного масла из семян чернушки дамасской в дозе 2,3 мл/кг стрессированным животным препятствовало инволюции тимуса, достоверно снижая ее выраженность при однократном введении на 35%, и практически полностью нормализовало данный показатель при курсовом применении. Кроме того введение ЭЖМЧД препятствовало развитию язвенного поражения слизистой желудка, достоверно уменьшая количество случаев изъязвления при однократном введении на 60,98% и при курсовом введении на 87,19% по сравнению с контрольной группой животных, а также нормализовало гормонально-медиаторный обмен.

Заключение. В ходе исследования установлено, что экстракт жирного масла семян чернушки дамасской обладает противострессорным, адаптогенным и антигипоксическим действием, а также низкой системной токсичностью применения. Также, основываясь  на полученных результатах, предполагается низкий токсический потенциал экстракта жирного масла семян чернушки дамасской. Установлена эффективная доза экстракта семян чернушки дамасской равная 2,3 мл/кг.

В отношении данной статьи не было зарегистрировано конфликта интересов.