Введение. Рост бытовых и производственных травм, а также ранений, полученных в ходе военных действий и бытовых конфликтов, определяет проблему лечения раневых повреждений как одну из основных в современной медицине. Поиск фармакологических средств, положительно влияющих на регенеративные и репаративные процессы в коже, особенно актуален в хирургии, экстремальной медицине, ветеринарии и косметологии.

Кожа человека содержит около 20% цинка от его общего содержания в организме. Дефицит цинка и нарушения его метаболизма являются патогенетическим звеном ряда кожных болезней. В настоящее время, кроме иммуномодулирущего, противовоспалительного, антиоксидантного, антибактериального действия цинка продемонстрировано его влияние на миграцию, пролиферацию и дифференцировку кератиноцитов. В многокомпонентном и динамичном механизме ранозаживления выделяют несколько фаз, в каждой из которой цинк как эссенциальный элемент играет важную биологическую роль. Цинк инициирует воспалительную фазу ранозаживления, вызывая высвобождение из альфа-гранул тромбоцитов хемокинов и цитокинов [1]. Этот микроэлемент способствует протеканию воспалительной и пролиферативной фаз процесса заживления, индуцируя более интенсивное образование и структурирование дермы [2].

Также в экспериментах invitro показано, что цинк снижает активацию ядерного фактора каппа В (NF-kB) и его генов-мишеней TNF-α и IL-1β, а также увеличивает экспрессию генов А20 и PPAR-α – белков по типу «цинковый палец», обладающих противовоспалительными свойствами [3]. NF-kB – мощный регулятор транскрипции, участвующий во множестве процессов, связанных с заживлением ран: воспаление [4], ремоделирование, пролиферация, апоптоз, клеточная адгезия и др. Известно, что цинк увеличивает количество регуляторных Т-лимфоцитов (Тreg), которые подавляют воспаление и способствуют реэпителизации раны [5].

В механизме ранозаживления важную роль играют многодоменные цинксодержащие металлопротеиназы (ММТ) [6], которые содержат в своей структуре каталитический цинксвязывающий домен. ММТ участвуют в деградации экстрацеллюлярного матрикса, миграции кератиноцитов, неоангиогенезе, пролиферации клеток, отложении коллагена и образовании фиброзной ткани. Таким образом, участие цинка в процессах дифференцировки и пролиферации, его противовоспалительная активность и мембраностабилизирующее действие позволяют предположить наличие ранозаживляющих свойств у комплексного соединения цинка с N‑изопропенилимидазолом.

Цель исследования. Сравнительное изучение влияния комплекса цинка производного N‑изопропенилимидазола под шифром Пилим-1 на течение раневого неинфицированного процесса при моделировании плоскостной кожной раны у крыс.

Материалы и методы исследования. Металлокомплекс цинка под лабораторным шифром Пилим-1 [(N‑изопропенилимидазол) цинкдиацетат] синтезирован в Иркутском институте химии СО РАН. LD₅₀ при внутрибрюшинном введении составляет 105 мг/кг.

Для исследования был приготовлен 1% гель Пилим-1 на основе натрий карбоксиметилцеллюлозы (Nа-KМЦ). Для это смешивали 0,05 г Nа-KМЦ, 0,05 г Пилим‑1 и 4,90 мл воды. Na-КМЦ является оптимальным носителем для геля, так как ее растворы стойки к действию микроорганизмов, нетоксичны, физиологически инертны, устойчивы в широком интервале рН, хорошо всасываются, обладают высокой связывающей, диспергирующей, смачивающей и адгезивной способностью [7]. В качестве препарата сравнения использовали метилурацила мазь 10% для наружного применения (AO «Нижфарм», STADA, Россия).

Исследование проведено на 24 аутбредных белых крысах-самцах массой 250–370 г, доставленных из питомника лабораторных животных «КролИнфо» (Московская область, Орехово-Зуевский район). Крысы содержались в виварии в индивидуальных клетках на стандартном рационе питания при температуре 20±2°C в обычном световом режиме и относительной влажности 50–70%. Все эксперименты одобрены Локальным этическим Комитетом Сеченовского Университета и проведены с обязательным соблюдением правил Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Strasbourg, 1986), в соответствии с «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [8].

Местное раздражающее действие Пилим-1 изучали при нанесении 1% геля на кожу и оценивали по появлению эритемы [9].

Животные случайным образом были разделены на 4 группы (n = 6): интактные (негативный контроль) – 1 группа, контроль (гидрофильная основа Na-КМЦ) – 2 группа, раны у животных 3 группы обрабатывали 1% гелем Пилим-1, 4 группы – метилурацилом.

Для воспроизведения модели плоскостных кожных ран у крыс, находящихся под наркозом, после введения комплексного наркозного средства Телазол^тм, выстригали шерсть и подшерсток на участке спины, недоступном для вылизывания, и вырезали кожный лоскут площадью 706,86 мм² (удаляя также подкожную жировую клетчатку) по специальному трафарету. Дефекты кожи оставляли открытыми на протяжении всего периода наблюдений. Заживление раневых повреждений у крыс оценивали, периодически снимая контуры ран на кальку и вычисляя площадь раны. Местное консервативное лечение ран проводили открытым способом (без повязки) путем нанесения исследуемых объектов на раневую поверхность один раз в день до полного заживления в течение 28 суток. Измерение ран проводили 2 раза в неделю. Среднюю массу «площади ран» определяли на аналитических весах следующим образом: в дни измерения наносили контуры ран на прозрачную пленку, а затем переносили на плотный ватман, после чего взвешивали.

Характер воспалительного процесса в каждой группе животных оценивали визуально.

По результатам проведенных исследований рассчитывали процент заживления ран по следующей формуле [10]:

(S – S_n) / S · 100%,

^,

где S – исходная площадь раны; S_n – площадь раны в день измерения.

Для гистологического изучения раневые биоптаты забирали на 29 сутки от начала лечения. Материал получали путем иссечения участка мягких тканей дна и прилежащего края раны. Взятые образцы сразу фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина с последующим дегидратированием и заливкой в парафин. Затем изготавливали гистологические срезы толщиной 3-4 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином. На гистологических срезах оценивали эпителизацию, степень выраженности грануляционной ткани и ее зрелость, наличие некроза и воспаления, ангиогенез, воспалительный инфильтрат, наличие фибробластов и лейкоцитов.

Статистическая обработка. Нормальность выборок проверяли по критерию Шапиро-Уилка. Так как выборки имели близкое к нормальному распределение, значимость различий между экспериментальными группами проводили с использованием t-критерия Стъюдента при помощи пакета программ IBM SPSS Statistics 23. Различия считались статистически значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. Изучение местного раздражающего действия 1% геля Пилим-1 не выявило появлений эритем или других нарушений состояния кожи животных, что подтверждает безопасность его применения при накожном нанесении.

В динамике процесса заживления у интактной группы с «естественным» процессом репаративной регенерации не было выявлено значимых отличий от показателей контроля. На 29 сутки эксперимента в контрольной группе ни у одного из животных не наблюдалось полного заживления раны. У крыс, получавших Пилим-1, более значимое заживление по сравнению с контрольной группой отмечалось на 10, 21, 24, 29 сутки. Полное ранозаживление в данной группе животных выявлено на 24 сутки. У 2 животных, получавших метилурацил, полное заживление ран наблюдалось на 29 сутки и у 1 крысы на 24 сутки наблюдения (рис. 1).

Более показательными являются данные гистологического анализа, для которого было случайным образом отобрано по 3 животных из каждой группы, у которых визуально отмечались наиболее значимые признаки ранозаживления (рис. 2).

Гистологические исследования. В контрольном образце (К1) отмечалась грануляционная ткань с признаками зрелости, некротический детрит на поверхности, неполная эпителизация. Характерен некроз, кровоизлияния, гемосидерин в глубоких слоях, большое количество лимфоцитов с примесью лейкоцитов (рис. 3). В образце К3 наблюдалась полная эпителизация и репарация, узелок грануляционной ткани, большое количество новообразованных сосудов и лимфоцитов, в глубоких слоях – в небольшом количестве гемосидерин. В образце К6 – признаки незрелой грануляционной ткани, большое количество клеточных элементов, множество лимфоцитов, тонкий эпителий, лимфоидная инфильтрация.

В образце кожи животного, получавшего Пилим-1 (П2), отмечалась полная эпителизация, восстановление придатков кожи, зрелая грануляционная ткань, лимфоидная инфильтрация, одинаковая толщина эпителия в прилежащих тканях и в ране, ремоделирование. В образцах кожи животных (П3 и П5) также наблюдались остатки грануляционной ткани, небольшой объем поражения, начальная регенерация придатков кожи, в глубоких слоях – гемосидерин.

В 2 интактных образцах отмечалась полная эпителизация с нормальной толщиной эпителия, следами грануляционной ткани с признаками зрелости, отсутствием придатков кожи. Характерно полное заживление. В третьем образце кожи интактного животного наблюдалась неполная эпителизация, базальная мембрана без эпителия, большое количество новообразованных сосудов, петехиальные кровоизлияния, некротический детрит и признаки воспалительной реакции на поверхности кожи, большое количество лейкоцитов, гемосидерин в глубоких слоях. Заживление отсутствует.

В образце кожи одной из крыс, получавших метилурацил (М2), отмечалось большое количество растянутых сосудов (неполная репарация), истонченный эпителий, под дермой – лимфоидная инфильтрация, гемосидероз, отсутствие лейкоцитов и некротического детрита, полная эпителизация. Во втором образце (М3) наблюдалась большая лимфоидная инфильтрация, полнокровные сосуды, инфильтрированный лейкоцитами и лимфоцитами базальный слой, эпителий и дерма не восстановлены, большое количество тонкостенных сосудов. В третьем образце (М6) под дермой находилось много воспалительного инфильтрата, более плотная дерма, грануляционная ткань с признаками зрелости, большое количество полнокровных сосудов, коллагена, фиброзирование дермы.

В настоящее время цинксодержащие препараты (цинка сульфат, цинка оксид, цинка гиалуронат, пиритион цинка) широко применяются при поражениях кожи различного характера. Известно, что антисептическим, вяжущим, подсушивающим, противомикробным действием обладает цинка сульфат. В экспериментальных исследованиях показано, что, проявляя противовоспалительную и антибактериальную активность, данный препарат не влияет на реэпителизацию [10].

Цинка оксид является популярнейшим неорганическим ингредиентом солнцезащитных средств, так как способен рассеивать и отражать УФ-лучи в диапазоне длин волн 290-400 нм. В исследовании на крысах показано положительное (по биохимическим, биомеханическим и гистологическим показателям) влияние крема с оксидом цинком и композитными наночастицами серебра на процесс заживления ран [11].

Одобренный FDA микробоцидный агент пиритион цинка (ZnPT) используется во всем мире в антисептических продуктах, местных противомикробных препаратах и косметических средствах. Однако, в исследовании на культурах эпидермальных кератиноцитов и меланоцитов человека была продемонстрирована уязвимость клеток к пиритиону цинка с выраженной экспрессией генов шокового ответа и истощением уровня АТФ [12].

Вышеназванные низкомолекулярные соединения цинка вследствие слабой биодоступности не могут обеспечить необходимую концентрацию микроэлемента в нужном месте, требуют длительного времени приема, отличаются выраженными побочными эффектами. Это можно объяснить отсутствием лиганда в их составе, что лишает данные вещества субстратной специфичности. Органический лиганд, являясь естественным редокс-регулятором, обеспечивает высокую биодоступность, и позволяет микроэлементу наиболее эффективно включиться в метаболизм путем воспроизведения функций металлоферментов в клетке.

Пилим-1 – координационный комплекс цинка, содержащий в качестве лиганда N-изопропенилимидазол. Известно, что имидазол и его производные содержатся в продуктах природного происхождения и играют важную биологическую роль в процессах, протекающих в живом организме. В последние годы в ряду производных имидазола и его конденсированных систем найдены вещества с антибактериальными, противопротозойными, противовирусными, антилейкозными, иммунодепрессивными и другими свойствами. В исследованиях на мышах, проведенных ранее, выявлена противогипоксическая активность Пилим-1 на моделях гипоксии разного генеза [13]. На наш взгляд, сигнальный характер поведения лиганда изопропенилимидазола позволяет доставить цинк к сотням других ферментов, активность которых зависит от этого микроэлемента.

Ранозаживление – сложный многокаскадный процесс, включающий несколько фаз, в каждой из которых участвуют ионы металлов, в первую очередь, цинк. Роль своеобразного «переключателя» от фазы пролиферации к дифференцировке играет сдвиг редокс-потенциала, поэтому применение вещества, проявляющего, на наш взгляд, свойства редокс-регулятора, и обеспечивающего баланс окислительно-восстановительных и свободно-радикальных процессов, наиболее эффективно.

Заключение. Таким образом, применение известных препаратов цинка сопровождается побочными эффектами и достаточно низкой эффективностью вследствие слабого усвоения кожей, что значительно ограничивает их применение и подчеркивает актуальность поиска новых более эффективных и безопасных лекарственных средств с дерматотропным действием.

Местное применение 1% геля производного N-изопропенилимидазола сокращает сроки заживления по сравнению с метилурацилом на модели плоскостной кожной раны. Положительные результаты подтверждены данными гистологического анализа.

Выявленное регенерирующее свойство комплекса цинка представляет интерес для дальнейшего изучения с целью разработки эффективного средства, стимулирующего репаративную регенерацию ран. Дерматотропное действие реализуется, вероятно, за счет высокой биодоступности, обеспечивающей фармакологическую эффективность, направленную на патогенетические механизмы раневого процесса: устранение гипоксии, улучшение микроциркуляции, регуляцию редокс-потенциала, нормализацию процессов свободно-радикального окисления и пролиферации клеток.