Введение. Белки семейства синуклеинов, представленные тремя членами семейства- альфа (α), бета (β) и гамма (γ)- синуклеинами, активно исследуются в связи с их вовлеченностью в патогенез нейродегенеративных заболеваний. Наиболее хорошо изучен белок α-синуклеин, для которого была показана ключевая роль в механизме формирования патологических белковых агрегатов – телец Леви, при Болезни Паркинсона (БП), вследствие чего подавляющее большинство работ посвящено изучению роли синуклеинов в патологических механизмах БП и других заболеваний, важным звеном патогенеза которых является синуклеинопатия [1].

Белки синуклеины являются многофункциональными: в норме они вовлечены в регуляцию нейротрансмиссии  [2]. Для α- и β-синуклеинов была показана способность связываться с везикуло-ассоциированным мембранным белком VAMP2 и участие в формировании SNARE-комплексов в пресинаптических терминалиях дофаминергических нейронов  [3, 4]. Третий члена семейства – γ-синуклеин, вовлечен в процессы формирования липидных рафтов и регуляцию липидного обмена, a нарушение функции γ-синуклеина ведет к усилению липолиза и изменению липидного гомеостаза  [5, 6].

Механизм, посредством которого синуклеины осуществляют взаимодействие с синаптическими везикулами и другими мембранными структурами, обусловлен наличием нескольких амфифильных последовательностей аминокислот (KTKEGV) на N-конце молекул белков данного семейства. Данные последовательности являются специфичными для липид-связывающих белков аполипопротеинов [7, 8]. Таким образом, способность связываться с липидами является физиологической функцией всех белков семейства синуклеинов, а связывание каждого из белков с липидами может компенсироваться другими белками семейства: в присутствии α-синуклеина возрастает степень связывания с мембранами β- и γ-синуклеинов. При этом одновременное присутствие β- и γ-синуклеинов ослабляло степень мембранно-связанного α-синуклеина [8]. Показанная на нокаутных по гену γ-синуклеина мышах резистентность к диете с высоким содержанием жиров и предотвращение ожирения за счет усиления липолиза и изменения состава липидов позволила рассматривать γ-синуклеин в качестве новой потенциальной молекулярной мишени для разработки терапии при лечении метаболических расстройств и регуляции массы тела [9].

Однако разработка непосредственной стратегии патогенетической терапии определенных метаболических расстройств осложняется недостаточной изученностью участия других синуклеинов в механизмах регуляции липидного гомеостаза, поскольку белки данного семейства обладают свойством функционального замещения. Все три белка семейства имеют высокую степень гомологии как на нуклеотидном, так и на аминокислотном уровне, и в экспериментальных условиях функция одного утраченного синуклеина может замещаться, по крайней мере частично, другими членами семейства [10]. Исследование липидного состава в мозге и печени у мышей с нокаутом всех трех генов семейства синуклеинов показало, что у этих животных изменен синтез жирных кислот и снижено содержание именно тех полярных липидов, которые являются основными компонентами липидных рафтов, участвующих в нейротрансмиссии и регулирующих транспорт дофамина [11]. При этом отсутствие всех трех синуклеинов приводило к более выраженным изменениям в метаболизме липидов, чем ранее выявленные изменения липидного гомеостаза у мышей с единичным нокаутом гена γ-синуклеина [6].

Цель исследования. Определение влияния отсутствия белков семейства синуклеинов на общее содержание липидов в печени и плазме крови, а также на соотношение различных классов липидов в этих тканях у мышей с генетическим нокаутом α, β- и γ-синуклеинов.

Материалы и методы исследования

Исследуемые животные

Линия трансгенных безсинуклеиновых мышей с нокаутом генов α-, β-, и γ-синуклеинов, содержалась на генетическом фоне C57Bl6/Chg в беспатогенном виварии ИФАВ РАН. Животные содержались при искусственно регулируемом 12-часовом цикле день/ночь и температуре 22°С со свободным доступом к воде и специальному корму, в котором жиры составляли 10% (подробный состав описан в [6]). Жирные кислоты были распределены в диете в следующем соотношении: 35% олеиновой кислоты, 25% линолевой кислоты, 20% пальмитиновой кислоты и 13% стеариновой кислоты. Работы с животными проводили в соответствии с этическими принципами и требованиями Хельсинкской декларации и приказом Минздрава России №199н от 1 апреля 2016 г. «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики». Проведение эксперимента было утверждено на заседании этического комитета ИФАВ РАН от 18.12.2020, протокол № 47.

Экстракция липидов

Стареющих самцов в возрасте 12 месяцев, по 6 самцов в экспериментальной и контрольной группах, умерщвляли методом цервикальной дислокации, производили сбор крови из желудочков сердца и на холоду извлекали печень. Немедленно экстрагировали липиды по методу Фолча и хранили при -20⁰С, как описано ранее [6].

Неполярные липиды разделяли методом одномерной тонкослойной хроматографии на пластинах силикагеля G 10x10 см² (Merck, Германия) в смеси растворителей (80 частей гексана: 20 частей диэтилового эфира: 1 часть ледяной уксусной кислоты), полярные липиды разделяли методом двумерной тонкослойной хроматографии на пластинах силикагеля G с 1,2% борной кислоты в смеси растворителя (65 частей хлороформа: 25 частей метанола: 4 части гидрохлорида аммония) в первом направлении и в смеси растворителя (90 частей N-бутанола: 20 частей ледяной уксусной кислоты: 20 частей воды) во втором направлении. Идентификацию липидов проводили по референсу на стандарты. Эфиры жирных кислот получали из фракции общих липидов нагреванием при 70⁰С при добавлении 2,5% серной кислоты и гексана в смесь метанол: толуол (2:1). Фракцию гексана переносили в чистую стеклянную пробирку, выпаривали в парах азота и растворяли в 50 мкл гексана. Идентифицировали эфиры жирных кислот методом газовой хроматографии на хроматографе Clarus 500 GC с пламенно-ионизационным детектором (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA) по описанной ранее методике  [5].

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили в программе GpaphPad Prism 8.0 (GraphPad, США). Нормальность распределения данных проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка, сравнение групп данных проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни. Достоверными считали различия при p <0,05.

Результаты и их обсуждение. Проведенный нами анализ выявил существенное снижение общего содержания липидов в печени безсинуклеиновых мышей по сравнению с контрольными животными дикого типа того же возраста. Содержание жирных кислот в пересчете на 100 мг ткани было исследовано у 6 животных каждого генотипа и составляло 3,5±0,73 мг/100 мг в печени безсикуклеиновых мышей и 5,2±0,84 мг/100 мг у контрольных мышей дикого типа. При этом в плазме крови безсинуклеиновых мышей такого выраженного снижения уровня липидов не наблюдалось. Более того, выявленное незначительное снижение содержания липидов в плазме крови безсинуклеиновых мышей до 0,26±0,44 мг/100 мг не было статистически достоверным по сравнению с таковым у контрольных мышей, которое составляло 0,32±0,56.

Снижение общего содержания липидов в печени безсинуклеиновых мышей сопровождалось также изменением их состава (Табл.). Так, процент общих полярных липидов существенно повысился в печени безсинуклеиновых мышей по сравнению с контрольными животными с 34% до 48,8%, в то время как относительное содержание триглицеридов снизилось с 63,7% до 50%, соответственно. При этом в плазме крови уровни полярных липидов и триглицеридов не менялись. Относительное содержание сложных эфиров стерола в печени безсинуклеиновых мышей снизилось почти в два раза с 2,3% до 1,2%, в то время как в плазме крови оно выросло с 16,4% до 21,3%. Интересно, что в плазме крови безсинуклеиновых мышей резко понизился уровень свободных (неэстерифицированных) жирных кислот с 11,1% до 4,8%.

Данные о снижении общей фракции липидов указывали на то, что отсутствие синуклеинов влияет на содержание липидов в печени. Дальнейший анализ состава жирных кислот в липидных фракциях показал, что их распределение действительно меняется при нарушении функции синуклеинов. Наиболее выраженными изменения оказались во фракции полярных липидов (Рис.). В этой фракции содержится большое количество насыщенных жирных кислот. Уровень пальмитиновой кислоты (C16:0) существенно повышен в печени и плазме безсинуклеиновых мышей по сравнению с животными дикого типа: 27,7±3,4 вместо 21,6±1,5 и 44,2±5,5 вместо 23,6±1,2, соответственно (Рис.).

Содержание олеиновой кислоты (C18:1n9) – другого компонента, составляющего существенную долю во фракции полярных липидов, также повышается у безсинуклеиновых мышей по сравнению с животными дикого типа как в плазме крови с 12,7±0,9 до 18,1±1,0, так и в печени с 13,0±1,0 до 15,2±0,8 (Рис.).

Наиболее драматичные изменения отмечены для линолевой кислоты (C18:2n6), содержание которой в 7 раз ниже в плазме крови безсинуклеиновых мышей, чем у животных дикого типа: 2,7±0,8 и 19,2±1,4, соответственно. При этом в печени ее содержание не меняется (рисунок). Также статистически достоверно был понижен уровень арахидоновой кислоты (C20:4n6) в печени с 15,7±1,7 до 10,4±2,7 у безсинуклеиновых мышей по сравнению с диким типом (Рис.).

Печень играет важную роль в метаболизме липидов и обеспечивает ими центральную нервную систему. Липидный метаболизм в печени влияет на концентрацию и состав липопротеидов, которые секретируются в плазму крови, что, в свою очередь, определяет состав липидов и жирных кислот в периферических тканях, включая мозг, где липопротеидам отводится важная роль в норме и при патологии. Появляется все больше экспериментальных свидетельств того, что в патогенезе БП важную роль играют нарушения липидного состава и метаболизма липидов, которые способны инициировать агрегацию потенциально амилоидогенных белков, в первую очередь, α-синуклеина  13]. Непосредственные механизмы, через которые осуществляется эта регуляция, остаются не до конца изученными.

В последнее время начали активно развиваться исследования по изучению роли нарушения липидного обмена в патогенезе БП. Например, было показано, что ингибирование активности фермента стеарил-коэнзим А(КоА)-десатуразы подавляет образование в модельных системах цитоплазматических включений, сформированных мутантными вариантами γ-синуклеина и β-синуклеина с повышенной афинностью к мембранным структурам [14]. Экспериментально было показано, что диета с высоким содержанием n3-жирных кислот способствует восстановлению двигательной и когнитивной функции у мышей после инъекции нейротоксина МФТП, моделирующего паркинсонический синдром  [15]. При этом достоверное снижение уровня жирных кислот группы n-3 – альфа-линолевой (С18:3n3) и докозагексаеновой (С22:6n3) было выявлено нами в плазме крови и печени безсинуклеиновых мышей. Таким образом, белки семейства синуклеинов могут рассматриваться в качестве модуляторов путей биосинтеза и метаболизма липидов.

Анализ состава жирных кислот в плазме крови и печени безсинуклеиновых мышей показал, что их распределение действительно меняется при нарушении функции синуклеинов. Содержание липидов в печени безсинуклеиновых мышей было значительно ниже, чем у контрольных животных дикого типа за счет снижения накопленных триацилгицеридов и эфиров стерола без изменения общего количества полярных липидов. При этом изменений в количестве циркулирующих триацилглицеридов и полярных липидов у безсинуклеиновых мышей не было выявлено, в то время как состав жирных кислот в плазме крови у этих животных был изменен. Данные о том, развивается ли при этом печеночная недостаточность у безсинуклеиновых мышей, отсутствуют, и, насколько нам известно, такие исследования не проводились.

Заключение. Основным результатом данной работы является обнаруженное изменение синтеза полиненасыщенных жирных кислот и этерификации основных полярных липидов ацильными цепями жирных кислот в печени, что сопровождается снижением содержания этих жирных кислот во фракции полярных липидов плазмы крови при нарушении функции синуклеинов. На основании этих данных нами было выдвинуто предположение о том, что дефицит белков семейства синуклеинов может оказывать влияние на гомеостаз липидов печени и последующий транспорт жирных кислот к периферическим тканям. Наши данные вносят важный вклад в теорию разработки принципиально новых подходов для создания эффективной терапии БП, основанных на принципах подавления прогрессии α-синуклеинопатии путем модуляции синтеза и/или катаболизма определенных типов липидов.

Информация о финансировании

Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-24-00995 (https://rscf.ru/project/22-24-00995) с использованием оборудования ЦКП ИФАВ РАН.