Введение. Гипертоническая болезнь (ГБ) характеризуется высокими значениями артериального давления (АД) (систолическое и/или диастолическое АД ≥140 мм рт.ст. и ≥90 мм рт.ст. соответственно) [1, 2]. и является одним из самых распространенных заболеваний в мире – в 2015 году ГБ было зарегистрировано у 1,13 млрд. человек [3]. ГБ встречается у 30-45% взрослых, с преимущественной распространенностью (>60%) у индивидуумов в возрасте >60 лет [4]. ГБ является существенным фактором риска развития ишемической болезни сердца, инсульта, хронических заболеваний почек и деменции [5]. При этом риск возникновения ишемической болезни сердца и инсульта удваивается с увеличением САД на каждые 20 мм рт. ст. (начиная со 115 мм рт. ст.) и ДАД на 10 мм рт. ст. (начиная с 75 мм рт. ст.) [5]. Наибольшее число смертей, связанных с САД, вызвано ишемической болезнью сердца, геморрагическим и ишемическим инсультом [6].

Роль наследственных факторов в формировании показателей АД является весьма существенной и не вызывает сомнений [7-11]. Материалы, полученные на основе близнецовых и семейных исследований, указывают на значительное влияние наследственности на уровень АД, которое по данным разных авторов варьирует в среднем в пределах 30-55% [10]. Согласно данным каталога полногеномных исследований (GWAS) – GWAS catalog [12] имеется информация о 118 выполненных GWAS в результате которых выявлено 586 полиморфизмов, ассоциированных с ГБ (информация на конец 2022 г.). Если еще учесть данные, полученные и в полно-экзомных исследованиях (EAWAS), то число полиморфных локусов, вовлеченных в формирование заболевания, будет превышать 1000 [8]. Согласно данным Padmanabhan S. et al. на настоящий момент времени в литературе имеется информация о 1,5 тыс. однонуклеотидных полиморфных локусах, связанных по данным GWAS, с различными фенотипами артериального давления (САД, ДАД, среднее АД, пульсовое АД) [11]. А с учетом имеющихся данных по «обычным» ассоциативным исследованиям ГБ с позиций различных генов-кандидатов [13-24], число полиморфизмов, связанных с развитием заболевания может достигать нескольких тысяч!

При всем этом мега-масштабном количестве генетической информации, имеющемся в распоряжении научных коллективов, занимающихся проблемой наследственной природы ГБ, дать ответ на вопрос «Какие же все-таки конкретные полиморфизмы/гены из известных на настоящий момент времени более нескольких тысяч таких полиморфизмов/генов (из них более 1,5 тысяч GWAS/EAWAS-значимых), определяют подверженность к ГБ у населения данного региона (и в том числе у жителей Центрального Черноземья России)?» весьма проблематично. Так как не всякий, даже GWAS/EAWAS-значимый полиморфизм, будет определять подверженность к ГБ в исследуемой популяции. И в этой связи особую актуальность приобретают репликативные исследования [25-29], направленные на подтверждение (или наоборот опровержение) роли полиморфизма генов, связанных с развитием ГБ по данным полно-геномных исследований, в формировании заболевания у жителей конкретной территории, имеющих свои особенности генетической «конституции», действия средовых факторов, межгенных и генно-средовых взаимоотношений и др., предопределяющих и особенности вовлеченности генов-кандидатов в формирование заболевания.

Цель исследования. Изучить связь GWAS-значимых для ГБ полиморфных локусов со стадиями заболевания.

Материалы и методы исследования. Для настоящего исследования была сформирована выборка больных ГБ в количестве 939 человека. В группу больных включались пациенты с параметрами АД – САД≥140 мм.рт.ст.; ДАД ≥90 мм.рт.ст. Выборка больных ГБ была сформирована на базе кардиологического и неврологического отделений Белгородской областной клинической больницы Св. Иоасафа. Диагностика ГБ проводилась сертифицированными специалистами-кардиологами областной клинической больницы согласно рекомендаций Всероссийского научного общества кардиологов. В соответствии со стадийностью заболевания все больные (n=939) были разделены на две группы – пациенты с 1-2-ой стадиями (n=384) и больные 3-ей стадией ГБ (n=555). Контрольная группа (параметры АД – САД<140 мм.рт.ст; ДАД<90 мм.рт.ст.) численностью 466 человек была одинакова для больных с 1-2-ой и 3-ей стадиями ГБ. Сформированные выборки больных и контроля были одинаковы по месту рождения (уроженцы Центрального Черноземья РФ) и национальности (русские) [30].

Согласно цели настоящей работы были отобраны полиморфные локусы генов-кандидатов, связанные с развитием гипертонической болезни по данным полно-геномных исследований [31]. В основу отбора полиморфных локусов для данной работы были положены следующие критерии: статистически значимые при уровне p≤5×10^-8 связи с ГБ (или параметры АД) по данным ранее выполненных полно-геномных работ [31]; встречаемость редкого аллеля 0,05 и более; наличие функциональных эффектов (связь с эпигенетическими характеристиками, транскрипцией генов согласно базы данных HaploReg, версия программы 4.1 [32]. В конечном итого из всего многообразия GWAS-значимых для ГБ (АД) локусов мы отобрали для настоящей работы и провели экспериментальное исследование десяти полиморфизмов десяти генов-кандидатов ГБ (АД) и в том числе AC026703.1 (rs1173771), HFE (rs1799945), BAG6 (rs805303), PLCE1 (rs932764), OBFC1 (rs4387287), ARHGAP42 (rs633185), CERS5 (rs7302981), ATP2B1 (rs2681472), TBX2 (rs8068318) and RGL3 (rs167479).

Для исследования вышеуказанных полиморфизмов ООО «Тест-Ген» (город Ульяновск) были разработаны наборы для генотипирования методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени [33]. Процедура генотипирования была выполнена на приборе-амплификаторе CFX96 (фирма производитель прибора Bio-Rad) в лаборатории кафедры медико-биологических дисциплин НИУ БелГУ согласно условий проведения ПЦР, представленных фирмой-разработчиком наборов (количество циклов и температурные режимы циклов). В работе выполнен контроль качества полученных экспериментальных данных (применялись положительные и отрицательные контрольные образцы, использовались «дублирующие» образцы).

Ассоциации изучались в соответствии с четырьмя генетическими моделями – аллельной (ALL), аддитивной (ADD), доминантной (DOM) и рецессивной (REC). Для минимизации вероятности ложноположительных результатов нами использовался пермутационный тест [34]. В качестве статистически значимого уровня был принят уровень p_perm ≤0,05 [35]. Вычисления проводились в Java-интегрированном программном ресурсе gPLINK-2.050. Для локусов, показавших значимые ассоциации со стадиями ГБ, был выполнен insilico анализ функциональных эффектов [36].

Результаты и их обсуждение. По всем анализируемым полиморфизмам как среди больных 1-2 стадиями так и среди пациентов с 3-ей стадией ГБ распределение генотипов в полной мере соответствует закономерностям Харди-Вайнберга, уровень значимости р_HWE у больных ГБ тяжелого течения по всем локусам превышает пороговое значение 0,05 (Табл. 1). Исследование ассоциаций аллелей SNP генов-кандидатов с ГБ различных стадий не выявило достоверных данных (Табл. 2). Статистически достоверных ассоциаций исследуемых полиморфных локусов с развитием ГБ 1-2-ой стадий заболевания (проводился логистический регрессионный анализ с учетом ковариат) в нашем исследовании не обнаружено (Табл. 3).

Методом логистической регрессии с коррекцией на ковариаты установлена ассоциация двух полиморфизмов – AC026703.1 (rs1173771,G/A) и HFE (rs1799945,C/G), с ГБ тяжелого течения (3-я стадия заболевания) (Табл. 4). Полиморфизм rs1173771 (G/A) AC026703.1 связан с развитием ГБ 3-ей стадии согласно доминантной (DOM) модели - минорный аллельный вариант А этого локуса имеет протективное значение для тяжелого течения заболевания OR_dom=0,63 и 95%CI_dom 0,41-0,98 (p_dom=0,040 p_perm=0,048). Полиморфный локус rs1799945 (C/G) HFE ассоциирован с риском неблагоприятного течения заболевания согласно рецессивной (REC) модели – минорный генотип данного полиморфизма существенно (более чем в 3 раза) повышает риск развития 3-ей стадии ГБ (OR_rec = 3,25 и 95%CI_rec 1,25-8,42 (p_rec=0,015 p_perm=0,017).

Итак, подводя итог проведенного исследования связи GWAS-значимых для ГБ полиморфных локусов со стадиями заболевания можно отметить значимую роль изучаемых SNP в формировании ГБ тяжелого течения (3-я стадия заболевания) и отсутствие их ассоциаций с ГБ 1-2 стадий. Повышает риск формирования 3-ей стадии ГБ генотип GG rs1799945 гена HFE (OR=3,25) а протективный эффект в отношении этой стадии заболевания проявляет аллель А в составе генотипов AA и GA rs1173771 гена AC026703.1 (OR=0,63).

Основываясь на insilico материалах, мы обнаружили существенные функциональные эффекты rs1799945 (C/G) HFE: данный полиморфизм приводит к аминокислотной замене His63Asp в полипептиде HFE, находится в регионе энхансеров в адипоцитах, энхансеров/промоторов в скелетной мускулатуре женщин. Выраженные регуляторные эффекты обнаружены для двух сильно сцепленных с ним локусов – rs198851 и rs198812, расположенных в регионе генов HIST1H4C и HIST1H2AC соответственно. Данные полиморфизмы локализуются в регионе открытого хроматина (35 и 1 органов/тканей соответственно), промоторов (24 и 16 органов/тканей соответственно) и энхансеров (1 и 15 органов/тканей соответственно), находятся в участках ДНК, взаимодействующих с регуляторными белками (8 и 2 соответственно) и факторами транскрипции (3 и 11 соответственно). В целом rs1799945 (C/G) HFE и сильно сцепленные с ним 7 локусов могут оказывать регуляторные влияния на 5 рядом расположенных с ними генов (HIST1H2AC, HFE, HIST1H4C, HIST1H2BC, HIST1H1T).

Следует отметить существенные eQTL и sQTL эффекты rs1799945 (C/G) HFE и сильно сцепленных с ними 4 SNP (eQTL (11 генов): HIST1H3E, BTN2A3P, RP11-457M11.5, GUSBP2, SLC17A1, HFE, SLC17A3, ZNF322, TRIM38, ALAS2, U91328.19 и sQTL (1 ген): HFE) и в том числе в аорте (HFE) (Рис.), артериях (HFE) (Рис.), сердце (HIST1H3E), надпочечниках (SLC17A1, SLC17A3, GUSBP2) (Рис.), щитовидной желез (HFE, TRIM38), жировой ткани (HFE,U91328.19, BTN2A3P), периферической крови (HIST1H3E, ALAS2, TRIM38), головном мозге (фронтальная кора (HIST1H3E), базальные ганглии (HIST1H3E), гипоталамус (HIST1H3E)), скелетной мускулатуре (HIST1H3E), печени (SLC17A3) и др. органах и тканях, имеющих патофизиологическое значение для развития ГБ. Итак, rs1799945 (C/G) HFE и сильно сцепленные с ним 7 локусов, согласно полученных нами данных, являются функционально значимыми для 15 генов – HIST1H2AC, ALAS2, HIST1H4C, BTN2A3P, ZNF322, GUSBP2, HFE, U91328.19, HIST1H1T, TRIM38, HIST1H2BC, SLC17A3, HIST1H3E, SLC17A1, RP11-457M11.5, за счет которых данный полиморфизм может «влиять» на патобиологию ГБ. Ряд из этих генов и, в частности, гены, кодирующие гистоновые белки (HIST1H4C, HIST1H1T, HIST1H2AC, HIST1H2BC, HIST1H3E), за счет того, что они входят в состав нуклеосом, и задействованы вследствие этого в формировании структуры хроматина, важны для регуляции процессов транскрипции и репликации [37]. В регуляции транскрипции генов участвует и ген ZNF322 (кодирует фактор транскрипции семейства цинковых пальцев), который влияя на MAPK сигнальный путь, является одним из «критических» регуляторов множества генов, транскрибируемых в сердце (как в эмбриональный период, так и у взрослого), и за счет этого ZNF322 является ключевым в развитии сердца и заболеваний сердечно-сосудистой системы и в том числе ГБ [38]

Важно подчеркнуть, что наши данные о рисковом влиянии генотипа GG rs1799945 гена HFE на возникновение ГБ 3-ей стадии (OR=3,25) полностью соответствуют результатам ранее выполненных полногеномных исследований [39-44]. При этом, во всех полногеномных исследованиях с более высокими показателями САД, ДАД, среднего АД, повышенным риском возникновения ГБ, так же, как и в нашей работе (высокий риск ГБ) ассоциирован аллельный вариант G rs1799945 гена HFE.

В настоящей работе insilico обнаружены значимые эпигенетические эффекты rs1173771 гена AC026703.1 и сильно сцепленных с ним 10 SNP по отношению к двум рядом расположенным генам (AC026703.1 и NPR3) и связь с экспрессией гена NPR3 в различных органах и в том числе в надпочечниках. При этом рисковый для ГБ 3-ей стадии аллель G rs1173771 определяет повышенную экспрессию этого гена, а протективный для заболевания аллель А rs1173771 – низкую транскрипционную активность этого гена.

Согласно данных онлайн ресурса GeneCards (https://www.genecards.org/) ген NPR3 (natriuretic peptide receptor 3) кодирует один из трех натрийуретических пептидных рецепторов. Продукт этого гена ответственен за «очистку» циркулирующих и внеклеточных натрийуретических пептидов посредством эндоцитоза соответствующего рецептора. Натрийуретические пептиды участвуют в регуляции объема крови, и в следствие этого оказывают непосредственное влияние на уровень артериального давления как в большом круге кровообращения, так и в малом круге. За счет вышеуказанных эффектов ген NPR3 может быть вовлечен в формирование ГБ, легочной гипертензии, нарушений сердечной функции. Для данного гена характерно множество вариантов транскриптов, кодирующих различные изоформы (https://www.genecards.org/).

В рамках использованной в нашей работе панели GWAS-значимых для ГБ полиморфных локусов Абрамовой М.Ю. было проведено генетико-эпидемиологическое исследование преэклампсии в популяции Центрального Черноземья России [31]. Выборка для исследования составила 452 женщины с преэклампсией и 498 беременных с физиологическим течением гестации. Включение авторами в анализ GWAS-значимых для ГБ полиморфных локусов было связано с тем, что одним из ключевых симптомов преэклампсии является повышенное АД и поэтому авторы предположили, что генетическими детерминантами этого повышенного АД у беременных с преэклампсией могут быть GWAS-значимые для ГБ полиморфные локусы. В результате данного исследования установлено, что полиморфизм rs1799945 HFE был ассоциирован с повышенным риском развития данного осложнения беременности (для генотипа GG OR=2,24). Обращает на себя внимание полное совпадение наших результатов, полученных для ГБ, с материалами, полученными Абрамовой М.Ю. для преэклампсии. Согласно наших данных минорный генотип GG rs1799945 гена HFE является фактором риска развития ГБ 3-ей стадии (OR=3,25) у населения Центрального Черноземья России. Обобщая полученные нами данные и результаты работы Абрамовой М.Ю. следует заключить, что у населения Центрального Черноземья России GWAS значимый для ГБ полиморфизм гена HFE (rs1799945, C/G) является «достоверным» маркером риска развития гипертензивных состояний (ГБ, преэклампсия) и может быть рекомендован для использования в клинической практике.

Заключение. В настоящей работе выявлена связь двух GWAS значимых генов-кандидатов AC026703.1 (rs1173771) и HFE (rs1799945) с риском формирования ГБ тяжелого течения (3-я стадия заболевания): альтернативный аллель А rs1173771 (G/A) AC026703.1 имеет протективное значение для тяжелого течения заболевания, а минорный генотип GG rs1799945 (C/G) HFE более чем в 3 раза повышает риск развития 3-ей стадии ГБ. Ассоциаций GWAS значимых для ГБ полиморфных локусов с развитием 1-2-ой стадий заболевания не установлено.