Введение. Рак легкого (РЛ) является одним из самых распространенных онкозаболеваний и ведущей причиной смертности от них во всем мире: по оценкам Международного агентства по изучению рака, в 2020 г. было зарегистрировано 2,2 миллиона новых случаев заболевания и 1,8 миллиона случаев смерти [1]. Основываясь на гистологии опухоли, выделяют два основных подтипа РЛ – немелкоклеточный (НМРЛ) и мелкоклеточный (МРЛ).

НМРЛ составляет приблизительно 85% всех случаев РЛ и представлен несколькими типами, в том числе аденокарциномой легкого (наиболее распространенный тип РЛ), плоскоклеточным раком и крупноклеточной карциномой.

В ходе геномных исследований, проведенных в рамках проекта Clinical Lung Cancer Genome Project, было выявлено, что для различных типов НМРЛ характерны специфичные изменения драйверных генов. В частности, при аденокарциноме легкого часто обнаруживаются активирующие мутации в гене рецептора эпидермального фактора роста EGFR и перестройки EML4-ALK. Кроме того, при данном типе РЛ идентифицированы мутации в генах LKB1/STK11, CDKN2A, NF1, KEAP1,KRAS, амплификация MET и перестройки ROS1 и RET [2]. При плоскоклеточном РЛ, напротив, мутации EGFR или перестройки EML4-ALK наблюдаются редко. Для этого типа РЛ характерны изменения в генах рецепторных тирозинкиназ, DDR2 и генах рецепторов фактора роста фибробластов, а также инактивирующие мутации в CDKN2A, PTEN, KEAP1, NFE2L2 и RB1 [3]. Перечень генов, мутации в которых свойственны для аденокарциномы легкого и плоскоклеточного РЛ, представлен на рисунке.

На долю МРЛ в глобальном масштабе приходится около 15% всех случаев РЛ, причем ежегодно диагностируется около 250000 новых случаев [6]. МРЛ представляет собой агрессивную нейроэндокринную опухоль высокой степени злокачественности, которая отличается исключительно высокой скоростью пролиферации и склонностью к раннему метастазированию. На момент постановки диагноза лишь у трети пациентов заболевание будет выявляться на ограниченной стадии. Для остальных пятилетняя выживаемость составляет менее 1%. Стоит отметить, что наиболее часто метастазы наблюдаются в контралатеральном легком, мозге, печени, надпочечниках и костях [7].

Для МРЛ показана выраженная связь с курением – только в 2% случаев МРЛ возникает у никогда не куривших [6]. Значительную роль в развитии МРЛ канцерогенов табачного дыма подтверждает мутационный профиль данного типа опухолей, характеризуемый множеством нуклеотидных перестроек. [7, 8]. Наиболее распространенным генетическим изменением при МРЛ является биаллельная инактивация генов-супрессоров опухолевого роста TP53 и RB1. Также часто выявляется увеличение числа копий генов, кодирующих члены семейства MYC (протоонкогены MYC, MYCL и MYCN), генов ферментов, участвующих в ремоделировании хроматина, рецепторных тирозинкиназ и их нижестоящих эффекторов, повышенный уровень экспрессии ингибиторных белков семейства Notch [6]. В таблице 1 отображены результаты масштабного исследования генома МРЛ.

Помимо этого, исследования последних лет позволили выделить четыре подтипа МРЛ, основываясь на различиях в экспрессии регуляторов транскрипции ASCL1 (achaete-scute homologue 1), NEUROD1 (neurogenic differentiation factor 1), YAP1 (yes-associated protein 1) и POU2F3 (POU class 2 homeobox 3) [13]. Впоследствии подтип МРЛ, определяемый экспрессией YAP1, не подтвердился [14]. Однако Gay с соавторами предложили ввести четвертый подтип МРЛ и назвать его воспалительным, поскольку для данной группы опухолей была характерна экспрессия генов многочисленных иммунных контрольных точек и человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA) [15].

Значение генетических изменений в злокачественной трансформации опухоли не вызывает сомнений. Тем не менее, в настоящее время признается существенной роль в канцерогенезе и эпигенетических механизмов контроля работы генома, которые включают в том числе специфические изменения метилирования ДНК, посттрансляционную модификацию гистоновых белков и изменения профиля экспрессии микроРНК.

Цель исследования. Обобщение результатов анализа метилирования ДНК при РЛ для лучшего понимания биологической природы онкогенеза данного заболевания, использования выявленных биомаркеров в ранней диагностике патологии и оценке прогноза пациента.

Метилирование ДНК у больных РЛ

Одной из наиболее изученных эпигенетических модификаций геномной ДНК является метилирование. Считается, что изменение профиля метилирования ДНК является одним из самых ранних молекулярных маркеров онкологических заболеваний человека [16, 17, 18]. Геном опухолевых клеток обнаруживает глобальное гипометилирование и региональное гиперметилирование, особенно в промоторных CpG-островках генов-супрессоров опухолевого роста [16]. Метилирование промоторных CpG-островков влияет на связывание транскрипционных факторов и таким образом может подавлять экспрессию совместно действующих генов, большинство из которых являются генами-супрессорами опухолевого роста, что отражает значение данного процесса в онкогенезе [19].

Очень часто исследования, посвященные метилированию ДНК у больных РЛ, проводятся на образцах периферической крови, ввиду значительно большей доступности материала. Несмотря на то, что паттерн метилирования ДНК в крови может и не отражать метилирование в ткани, он может быть показателем серьезных иммунологических изменений или изменений эпигенетической программы, значимых в процессе развития заболевания.

Значительное количество работ по анализу метилирования при РЛ показало прямую связь этого явления с курением [20, 21, 22]. Так, в метаанализе, включавшем около 16000 образцов ДНК курящих и некурящих индивидов, было выявлено 2623 дифференциально метилированных CpG сайта, связанных с курением табака. Для генов, в которых локализованы данные CpG, ранее в полногеномных исследованиях были показаны ассоциации с развитием вызванных курением патологий легких, сердца, воспалительных и онкологических заболеваний [23]. Кроме того, сравнение профилей экспрессии у никогда не куривших и бросивших курить обнаружило 185 дифференциально метилированных CpG сайтов, что отражает устойчивое изменение паттерна метилирования у индивидов, сохраняющееся даже после прекращения воздействия курения.

Связь метилирования ДНК и статуса курения была показана и в других работах. Baglietto с соавт. в результате полногеномного эпигенетического исследования (EWAS) обнаружили 6 CpG сайтов, гипометилирование которых ассоциировано с развитием РЛ, в том числе описанные ранее сайты в генах AHRR (репрессор арилгидрокарбонового рецептора) и F2RL3 (белок 3, подобный рецептору фактора коагуляции II (тромбина)) [20, 22]. Интересно, что уровень метилирования в изученных образцах изменялся градиентно от курящих на момент забора материала к прекратившим курить и никогда не курившим, и был тем выше, чем раньше пациент прекращал курить [22].

В более поздней работе Sandanger с соавторами выявили 25 CpG сайтов, ассоциированных с развитием РЛ, причем после введения поправки на воздействие курения статистически значимая ассоциация сохранилась лишь для двух сайтов, таким образом, они рассматриваются как несвязанные с курением, тогда как остальные 23 CpG сайта связаны с развитием РЛ у курящих. В целом, показано, что ассоциация для 23 CpG сайтов была выше в гистологических типах РЛ, наиболее коррелирующих с курением. Сравнение экспрессионных профилей показало различные пути обогащения таких сайтов, т.е. CpG сайты, связанные и не связанные с курением, по-видимому, вовлечены в различные биологические процессы. Нужно отметить, что в данном исследовании выявленные ранее CpG сайты в генах AHRR и F2RL3 оказались в числе тех, что были ассоциированы с курением [24].

В исследовании Battram с соавторами также было выявлено 16 CpG сайтов, ассоциированных с риском развития РЛ, однако после менделевской рандомизации данная ассоциация существенно снизилась [25]. В частности, полученные ими результаты не согласуются с предыдущими данными, свидетельствующими о том, что CpG сайты в генах AHRR и F2RL3 опосредуют более 30% эффекта курения на развитие РЛ [20]. Можно предположить, что наблюдаемая ранее ассоциация изменений метилирования ДНК с риском развития РЛ возникает как результат внесения поправок на сведения о курении, полученные от пациентов [26, 27]. К таким сведениям относятся количество выкуренных сигарет в течение жизни (более или менее 100 сигарет), статус курения на момент исследования, регулярность курения. При применении в EWAS-исследованиях более строгих поправок, данные ассоциации также пропадают.

Курение значительно изменяет паттерн метилирования ДНК, который сохраняется даже после его прекращения, и, по-видимому, это является одним из механизмов, объясняющих негативное воздействие его на здоровье человека. Тем не менее, наблюдаемая ассоциация между метилированием ДНК и развитием РЛ может отражать независимые влияния курения на метилирование и на развитие РЛ.

Выявление изменений метилирования ДНК, не связанных с активным курением, позволит обнаружить новые биологические пути, функционирование которых значимо в контексте развития РЛ. Тем не менее, на сегодняшний день таких исследований очень мало.

В одном из них выявлены 151 CpG сайт, связанный с курением, и 3806 CpG сайтов, не связанных с курением, и далее проведен анализ ассоциации их со смертностью от РЛ. CpG сайты, связанные с курением, оказались ассоциированы со смертностью от РЛ с большей значимостью [28]. Результаты подобных исследований могут способствовать более точному отбору популяции для скрининга РЛ.

При изучении роли в развитии РЛ сайленсинга генов посредством их метилирования выявляется множество ассоциированных CpG сайтов в различных локусах, и анализ такого объёма данных требует значительных ресурсов, в связи с чем целесообразнее было бы определять основные драйверные гены, изменение профиля метилирования которых вовлечено в онкогенез. Для выявления таких ключевых генов Zhang с соавторами при исследовании образцов опухолевой и прилежащей к ней нормальной ткани легкого проводили сопоставление данных по метилированию с экспрессионными данными. В результате данного анализа ими было установлено 30 драйверных генов с измененным профилем метилирования, ассоциированных с развитием РЛ у некурящих индивидов [29].

В другом недавнем исследовании, проведенном на когорте CLUE II (образцы крови пресимптоматических индивидов, забранные в 1989 г. в США), авторы проводили поиск отдельных CpG сайтов и дифференциально метилированных регионов (ДМР), ассоциированных с развитием РЛ независимо от курения [30]. Выборка включала две группы индивидов: тех, кто позднее заболел РЛ, и тех, у кого данное заболевание выявлено не было. Оценку роли участков метилирования ДНК в развитии РЛ проводили, опираясь на данные об известных изменениях паттерна метилирования, связанных с курением, с использованием индекса пачка/лет.

Авторами выявлено 16 CpG сайтов и 40 ДМР, ассоциированных с развитием РЛ, причем значение OR было выше для бывших курильщиков и для пациентов с МРЛ, по сравнению с пациентами с НМРЛ. Данные участки с измененным метилированием локализованы в генах H19, HOXA3/HOXA4, RUNX3, BRICD5, PLXNB2, RP13 и DIABLO, для которых ранее показана ассоциация с РЛ [31, 32, 33].

Продукты генов гомеобоксных белков HOXA являются факторами транскрипции, регулирующими экспрессию генов, морфогенез и дифференцировку тканей. Известно, что экспрессия фактора транскрипции HOXA3 снижена при аденокарциноме и плоскоклеточном РЛ. Кроме того, показано, что у курящих индивидов уровень HOXA3 заметно ниже, чем у некурящих [34]. Сравнение паттерна метилирования в опухоли и прилегающей нормальной ткани при аденокарциноме выявило ассоциацию с ДМР в области гена HOXA3 [35]. Ген другого фактора транскрипции RUNX3 также является опухолевым супрессором. Гиперметилирование промотора данного гена ассоциировано со снижением выживаемости при РЛ [36]. Кодируемый геном DIABLO митохондриальный белок является проапоптотическим белком и обеспечивает активацию каспаз путем связывания с белками-ингибиторами апоптоза. Различные исследования свидетельствуют об участии данного белка в онкогенезе. Одними авторами предполагается, что повышенная экспрессия его повышает чувствительность опухолевых клеток к апоптозу, предотвращая таким образом опухолевую прогрессию [37]. Другие исследователи рассматривают гиперэкспрессию DIABLO необходимым звеном в запуске опухолевой метаплазии [38].

Также известна роль длинной некодирующей РНК H19 в развитии РЛ. Угнетение экспрессии Н19 приводит к подавлению роста, миграции и инвазии при НМРЛ. Подавление её импринтинга коррелирует с тотальным деметилированием и ассоциировано с трансформацией нормальной ткани в НМРЛ [39, 40].

В вышеописанной работе Zhao с соавторами была выявлена ассоциация гиперметилирования многих CpG сайтов в области гена H19 с развитием РЛ. Ранее же в других исследованиях была показана гиперэкспрессия Н19 в опухоли РЛ, которая коррелирует с гипометилированием промоторных CpG [41].

Интересно, что метилирование региона H19 подвержено воздействию разнообразных модифицирующих влияний, начиная с внутриутробного периода и раннего детства, что может говорить о возможной роли в данном процессе внешних факторов. Это может иметь значение при изучении различных механизмов онкогенеза, его этапов и ключевых элементов.

Результаты многих исследований РЛ в последнее время демонстрируют снижение экспрессии вследствие гиперметилирования ряда генов супрессоров опухолей, в т.ч. CDKN2A, APC, RARβ, MGMT, DAPK, F2RL3 и RASSF1A [42, 43, 44]. Ген RASSF1A, кодирующий белок семейства 1А, содержащий Ras-ассоциированный домен, является одним из наиболее тщательно изученных супрессоров опухолевого роста, функционально он участвует в пролиферации клеток, миграции и онкогенезе [45]. Онкоген SHOX2 (гомеобокс содержащий ген низкорослости 2) является регулятором клеточной пролиферации и апоптоза и индуктором эпителиально-мезенхимального перехода [46]. Помимо онкогенных функций SHOX2 также играет значительную роль в процессах эмбрионального развития и дифференцировки клеток сердечно-сосудистой системы и в развитии скелета [47, 48]. Важно отметить, что часто в ткани РЛ выявляется метилирование как гена RASSF1A, так и SHOX2 [49, 50, 51]. Ряд исследований показали, что сочетанное метилирование генов RASSF1A и SHOX2, выявленное в различных типах образцов, включая бронхоальвеолярный лаваж, сыворотку, жидкость из плевральной полости, образцы асцитической жидкости, клетки и лимфатические узлы, продемонстрировало чрезвычайно высокую чувствительность и специфичность при РЛ [49-53]. Имеющиеся данные убедительно свидетельствуют о том, что метилирование RASSF1A и SHOX2 является критическим событием в онкогенезе и прогрессировании РЛ, и эти модифицированные гены могут служить потенциальной парой биомаркеров для скрининга РЛ на ранних или поздних стадиях [42, 48, 51, 54, 55].

Метилирование ДНК при МРЛ

Глобальных исследований метилирования ДНК, посвященных исключительно МРЛ, существенно меньше, чем для НМРЛ, и они проведены на ограниченном числе образцов [56, 57]. В одном из первых анализов профиля метилирования при МРЛ [56] было идентифицировано 73 гена, аберрантно метилированных в более чем 77% первичных опухолей. Анализ генных онтологий показал значительное обогащение метилированных генов, функционирующих как транскрипционные факторы и участвующих в процессах нейрональной дифференциации. Анализ опухоль-специфических метилированных областей выявил обогащение сайтов связывания нескольких транскрипционных факторов нейрональных клеток, включая NEUROD1, HAND1, ZNF423 и REST. Авторы предполагают два вероятных механизма нарушения дифференцировки нейроэндокринных клеток, что стимулирует клетки-предшественники опухоли к трансформации в МРЛ. Первый – инактивация путем метилирования транскрипционных факторов, необходимых для правильной дифференцировки клеток, второй – функциональная инактивация путем метилирования соответствующих ДНК-связывающих участков [56].

Авторы другого исследования, в ходе которого был проведен полногеномный анализ метилирования ДНК в легочной ткани больных МРЛ, обнаружили повышенную экспрессию при МРЛ гистоновой метилтрансферазы EZH2, которая коррелирует с метилированием промоторов множества генов при различных типах опухолей и ассоциирована с плохим прогнозом. В экспериментах на клеточных линиях показано, что ингибирование EZH2 приводит к подавлению роста клеток опухоли, что делает данный белок потенциальной терапевтической мишенью при МРЛ [57]. Кроме того, выявлен сайленсинг других генов, в т.ч. транскрипционных факторов NEUROD1, TCF2 (HNF1B), REST, бета-рецептора ретиноевой кислоты RARB, BCL2 и RASSF1A.

Также результаты данной работы продемонстрировали гипометилирование большинства CpG в первичных опухолях МРЛ по сравнению с образцами здорового легкого. Было показано, что гиперметилированные CpG сайты локализованы преимущественно в области 500 пн выше сайта старта транскрипции, тогда как гипометилированные распределены по всей промоторной области. Причем, обнаружилось неоднородное распределение и самих наиболее гипометилированных CpG сайтов в зависимости от их влияния на экспрессию гена: CpG, ассоциированные с повышенной экспрессией гена, локализованы ниже, а CpG, ассоциированные с сайленсингом гена, – выше старта транскрипции [57].

У многих форм злокачественных новообразований у человека описан так называемый CIMP-фенотип (CpG-island methylator phenotype), который характеризуется одновременным метилированием многих CpG островков промоторной области генов, в нормальной ткани никогда не метилированных. В исследовании Saito с соавторами проведена стратификация образцов МРЛ в соответствии со статусом CIMP. Оказалось, что пациенты с CIMP-положительными опухолями имели худший прогноз, чем пациенты с CIMP-отрицательным заболеванием [58]. Эти данные предполагают, что клинически значимые подтипы МРЛ определяются паттернами метилирования ДНК, что согласуется с наблюдениями среди других эпитипов карциномы легких [6, 59].

Роль метилирования ДНК при МРЛ в ответе опухоли на химиотерапию и лучевую терапию

Одна из особенностей МРЛ состоит в том, что у большинства пациентов наблюдается хороший первоначальный ответ на химиотерапию и лучевую терапию, однако в течение 6-12 месяцев почти у всех больных развивается рецидив с переходом заболевания в резистентную форму [60]. Несмотря на все большее количество доказательств роли эпигенетических факторов в развитии МРЛ, понимание их влияния на ответ опухоли на лечение остается ограниченным. Чтобы получить представление о том, как метилирование ДНК может влиять на ответ опухоли на лечение при МРЛ, Krushkal с соавторами провели полногеномный анализ метилирования ДНК на 66 линиях клеток МРЛ человека [61]. Ими были изучены корреляции метилирования ДНК при МРЛ с чувствительностью к противоопухолевым препаратам.

Потенциально важная ассоциация наблюдалась для гена экзонуклеазы TREX1. Повышенное метилирование и сниженная экспрессия TREX1 были ассоциированы с чувствительностью к некоторым ингибиторам киназы Aurora и ряду других препаратов. По сравнению с клеточными линиями других типов рака, TREX1 характеризовался сниженной экспрессией мРНК и повышенным метилированием вышележащей области при МРЛ, что предполагает наличие возможной связи с чувствительностью МРЛ к ингибиторам киназы Aurora. Krushkal с коллегами также идентифицировали несколько дополнительных корреляций, указывающих на потенциальные механизмы химиочувствительности. Ассоциация ответа на ингибиторы киназы Aurora и другие химиотерапевтические агенты обнаружена также с метилированием генов CEP350, MLPH, EPAS1, KDM1A, EZH2 и EPHA2 [61] (Табл. 2).

В недавнем исследовании Zhai с соавторами продемонстрировали роль гена каталитической субъединицы теломеразы человека (hTERT) в развитии МРЛ. Ими было показано, что метилирование промотора данного гена способствовало прогрессированию МРЛ и резистентности клеток опухоли к лучевой терапии [62]. Сверхэкспрессия hTERT приводила к увеличению транскрипции ряда маркеров эпителиально-мезенхимального перехода, в том числе OCLN, JUP и ZEB, и, таким образом, способствовала миграции клеток МРЛ. Также было выявлено, что повышение экспрессии hTERT влекло повышение экспрессии EZH2, за счет чего усиливалась пролиферация клеток МРЛ.

Другой эпигенетический терапевтический подход к лечению МРЛ открывают исследования по ингибированию лизин-специфической деметилазы 1 (LSD1) [63, 64]. LSD1 представляет собой белок, содержащий флавин и функционирующий как гистондеметилаза и корепрессор транскрипции [65]. Данный белок является широко изученным членом семейства LSD, и повышенная экспрессия его показана при многих видах рака, включая подтипы МРЛ. Белок LSD1 деметилирует гистон H3 по четвертому лизину, что приводит к подавлению транскрипции, или деметилирует данный гистон по девятому лизину, что имеет противоположный эффект [66].

Augert с соавторами показали, что ингибирование LSD1, опосредованное его селективным ингибитором ORY-1001, приводит к активации сигнального пути NOTCH и подавляет экспрессию транскрипционного фактора ASCL1, что тормозит прогрессирование МРЛ [64]. Активация NOTCH, наряду с ингибированием ASCL1, имеет терапевтический потенциал при МРЛ, поскольку высокий уровень экспрессии NOTCH и низкий уровень ASCL1 также подавляет дифференцировку нейроэндокринных клеток. Ингибитор ORY-1001 продемонстрировал эффективность на хеморезистентных моделях ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с МРЛ.

Mohammad с коллегами сообщили о другом селективном, биодоступном при пероральном введении сильнодействующем ингибиторе LSD1 (GSK2879552), который проявляет противоопухолевые свойства на клеточных линиях МРЛ и моделях опухолей [63]. Эффективность GSK2879552 зависела от статуса метилирования ДНК. Авторами был подобран набор из 45 дифференциально метилированных зондов, способных предсказывать чувствительность МРЛ к данному препарату. Статус гипометилирования этого набора зондов позволяет стратифицировать пациентов с МРЛ, которые могут реагировать на ингибирование LSD1 с помощью GSK2879552 [63, 67].

Заключение. В целом, исследования метилирования при МРЛ призваны прояснить биологическую природу онкогенеза при данном заболевании. Различия в профилях метилирования ДНК, выявляемые у разных индивидов, могут отражать различную генетическую предрасположенность к РЛ. Это может быть обусловлено некоторыми индивидуальными различиями в системе детоксикации ксенобиотиков, в том числе канцерогенов, либо различиями в функционировании систем репарации, которые должны восстанавливать возникающие вследствие стрессовых влияний нарушения. С другой стороны, различия в метилировании могут отражать и эффект от воздействия различных факторов, поступающих из внешней среды.

С учетом того, что для эпигенетических маркеров характерна достаточная пластичность, любые изменения в метилировании ДНК, ассоциированные с развитием РЛ, могли бы быть использованы в качестве мишеней для терапевтического воздействия. Полученные в результате множества исследований результаты дают надежды на расширение арсенала химиотерапевтических препаратов. Помимо этого, немаловажным аспектом является потенциальное применение выявляемых маркеров для ранней диагностики заболевания и оценки прогноза пациента.

Тем не менее, возникают определенные трудности с правильным определением и точным анализом эпигенетических маркеров. Данные маркеры чувствительны к различным, в том числе обратным воздействиям в процессе онкогенеза. Кроме того, иногда затруднительно их отделить от влияния социо-экономических факторов. Таким образом, для дальнейшего анализа требуется детальное изучение биологических путей и определение всех ключевых их компонентов.

Информация о финансировании

Работа проведена при финансовой поддержке Санкт-Петербургского государственного университета (проект № 93025749) и мегагранта Правительства Российской Федерации № 075-15-2021-595.