Введение. Антропометрические характеристики плода являются важным показателем исхода беременности и напрямую зависят от нормального процесса плацентации [1]. Нарушение развития плаценты будет приводить к плацентарной недостаточности и развитию таких осложнений беременности, как задержка роста плода и преэклампсия [2, 3, 4]. Задержка роста плода (ЗРП) возникает, когда плод не достигает своего внутриутробного потенциала роста в результате нарушения функции плаценты, при этом его размер <10-го процентиля для данного срока гестации [1]. ЗРП является распространенным осложнением беременности с частотой встречаемости до 10% во всем мире [5]. Это состояние сопряжено со значительными рисками неонатальной заболеваемости и смертности, и является основной причиной мертворождений [5]. Долгосрочные последствия ЗРП для здоровья связаны с более частой встречаемостью сердечно-сосудистых и метаболических заболеваний во взрослом возрасте [6].

Патогенез ЗРП сложен и связан с влиянием различных факторов (материнских; плацентарных; внутриутробных) [7], последовательно приводящих к аномальной трансформации спиральных артерий, нарушению плацентации, развитию плацентарной недостаточности и ЗРП [8]. Тем не менее, конкретные механизмы, инициирующие или запускающие этот патологический процесс, ещё до конца не изучены [8].

В процессы инвазии вневорсинчатого трофобласта в стенку спиральных артерий вовлечены матриксные металлопротеиназы (ММП) – особая группа эндогенных протеолитических гидролаз, которые могут разрушать различные компоненты внеклеточного матрикса [9]. Данная группа ферментов играет решающую роль в пролиферации, миграции и дифференцировке клеток, восстановлении и ремоделировании тканей, эмбриогенезе [10, 11]. Изменение плазменной концентрации и/или уровня экспрессии ММП могут приводить к снижению инвазивной способности клеток трофобласта, отложению коллагена, недостаточному ремоделированию спиральных артерий, ишемии и гипоксии плаценты, и, как следствие, являться фактором риска развития ЗРП [12-18].

Молекулярно-генетические исследования по поиску ассоциаций полиморфизма генов матриксных металлопротеиназ с задержкой роста плода и/или весом новорожденного были проведены относительно давно и количество таких исследований ограничено [19, 20]. Актуальные работы по изучению роли полиморфизма генов ММП в развитии осложнений беременности посвящены в основном изучению преэклампсии в различных популяциях мира [21, 22, 23]. Недостаточность молекулярно-генетических исследований по оценке роли полиморфизма генов ММП в формировании веса новорожденного диктует необходимость дальнейшего проведения таких работ.

Цель исследования. Изучить взаимосвязи полиморфизма генов матриксных металлопротеиназ с весом новорожденных у беременных с задержкой роста плода в популяции Центрально-Черноземного региона России.

Материалы и методы исследования. В это исследование были включены 98 беременных с синдромом задержки роста плода, проходившие обследование на базе Перинатального центра Белгородской областной клинической больницы (c 2008 по 2015 год). Все женщины предоставили информированное согласие на включение в исследование. Комитет по этике медицинского института НИУ БелГУ одобрил дизайн этого исследования. При формировании выборки использовались следующие критерии включения: место рождения и проживания – Центрально-Черноземный регион России; русская национальность; однополая беременность, закончившаяся живорождением. К критериям исключения относили: многоплодная беременность, врожденные порки развития плода/новорожденного, врожденные аномалии матки. Диагностика ЗРП проводилась на основании ультразвуковой фетометрии (определение окружности живота плода, окружности головы, бипариетального диаметра и длины бедренной плечевой кости). Предполагаемый вес плода был рассчитан с использованием формулы Hadlock. ЗРП определяли как массу плода <10-го процентиля средней массы нормального плода того же гестационного возраста.

Для молекулярно-генетического тестирования было отобрано 5 однонуклеотидных полиморфизма генов матриксных металлопротеиназ: rs1799750 MMP-1, rs243865 MMP-2, rs3025058 MMP-3, rs11568818 MMP-7, rs17577 MMP-9. Данные локусы являются функционально значимыми, т.к. связаны с эпигенетическими изменениями и транскрипцией в соответствующих генах (данные получены insilico с помощью онлайн ресурса Haploreg v.4.2, https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php).

Экстрагирование ДНК из венозной крови проводилось стандартным методом фенол-хлороформной экстракции. Генотипирование ДНК-образцов проводилось методом ПЦР-синтеза ДНК с использованием олигонуклеотидных праймеров и TagMan зондов методом дискриминации аллелей.

Ассоциации между SNP организма матери и весом новорожденного оценивались методом лог-линейного регрессионного анализа (использовался пакет программ gPLink) [24]. Так как распределение веса новорожденного не было нормальным (критерий Шапиро-Уилка), использовались его трансформированные значения. Направленность ассоциативной связи оценивалась при помощи коэффициента регрессии (β) и его ошибки (SE) (описывают изменение трансформированного показателя веса новорожденного на минорный аллель). Для оценки индивидуальных эффектов SNP использовались аллельная, аддитивная, доминантная и рецессивная генетические модели с коррекцией на ковариаты (возраст, ИМТ матери до беременности) и множественные сравнения (использовались адаптивные пермутационные процедуры с расчетом показателя p_perm). В конечном итоге, показатель p_perm<0,05 принимался за статистически значимый.

SNP, показавшие значимые ассоциации с весом новорожденного, оценивались на их связь с несинонимическими заменами (PolyPhen-2, http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), эпигенетическими эффектами (HaploReg (v4.2), https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php), экспрессией и альтернативным сплайсингом генов (GTEx portal, https://www.gtexportal.org/home/).

Результаты и их обсуждение. Установлены ассоциации полиморфизма rs11568818 гена матриксной металлопротеиназы 7 (MMP-7) с весом новорожденного у женщин с ЗРП в рамках рецессивной модели (Табл. 1). Выявлено, что минорный аллель С rs11568818 MMP-7 статистически достоверно связан с более высоким весом новорожденного (β = 0,32±0,13, p=0,016 p_perm=0,022). Соответственно, референсный аллель Т rs11568818 MMP-7 будет ассоциирован с более низкой массой тела новорожденного.

По данным онлайн ресурса HaploReg (v4.2) rs11568818 MMP-7 расположен в эволюционно-консервативном регионе, сайте модификации гистонов, маркирующих промоторы и энхансеры в тканях и органах взрослого организма и плода (4-7 тканей), сайтах связывания с регуляторными белками (TBP, CFOS, CJUN), регионе гиперчувствительности к ДНКазе (всего 15 тканей, в том числе мезенхимальные и гемопоэтические стволовые клетки,) (Табл. 2). При этом, обращает внимание, что полиморфизм rs11568818 MMP-7 локализован в сайте модификации гистонов, маркирующих энхансеры и промоторы, в тканях и органах взрослого организма и плода, связанных с весом и ростом новорожденного, а именно: мезенхимальные и гемопоэтические стволовые клетки, клетки остеобластов, адипоциты, различные отделы головного мозга, и др.

Также rs11568818 MMP-7 локализован в области сайта связывания с четырьмя регуляторными мотивами ДНК (факторы транскрипции) Foxa, GR, PLZF, Pou5f1. Разница LOD scores аллеллей T и C для Foxa составляет 5,1, для фактора GR – -0,8, для PLZF – 1,4, для Pou5f1 – 3,2. Исходя из этого, аллель Т rs11568818 MMP-7, связанный с более низким весом новорожденного, повышает афинность к ДНК-мотивам Foxa, PLZF, Pou5f1 и снижает аффиность к фактору GR.

Стоит отметить, что полиморфизм rs11568818 MMP-7 находятся в неравновесии по сцеплению (r²>0,4) с 5 полиморфными маркерами, отличающимися значимыми регуляторными эффектами: данные локусы находятся в области сайта связывания с различными факторами транскрипции (от 1 до 7 факторов) (Табл. 2). Помимо этого, rs1943779 MMP-7 локализован в регионе гиперчувствительности к ДНКазе в тканях почек и в сайте модификации гистонов, маркирующих энхансеры в цельной крови.

С помощью онлайн-ресурса GTEx Portal установлено, что аллель Т rs11568818 MMP-7 связан с более низким уровнем экспрессии гена MMP-7 в различных органах и тканях: легкие (β=-0,33, р=2,4*10^-17, pFDR≤0,05), печень (β=-0,48, р=6,1*10^-9, pFDR≤0,05), скелетная мускулатура (β=-0,15, р=2,2*10^-4, pFDR≤0,05).

В итоге, rs11568818 MMP-7, ассоциированный с весом новорожденного, обладает важными функциональными эффектами. Он локализован в эволюционно-консервативном регионе, сайте связывания с регуляторными белками (TBP, CFOS, CJUN), регионе гиперчувствительности к ДНКазе, и сайте модифицированных гистонов, маркирующих энхансеры и промоторы в мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клетках, клетках остеобластов, адипоцитов, различных отделов головного мозга и др., определяет чувствительность ДНК к четырем факторам транскрипции (Foxa, GR, PLZF, Pou5f1), связан с уровнем экспрессии мРНК гена MMP-7 в легких, печени, скелетной мускулатуре.

Ген MMP-7 кодирует матриксную металлопротеиназу 7 (ММП-7), являющуюся одним из представителей большого семейства цинк (II)-зависимых белковых гидролаз, которые могут разрушать различные компоненты внеклеточного матрикса [9, 25]. ММП вырабатываются клетками плаценты и матки, включая фибробласты, эндотелиальные клетки, макрофаги, гладкие миоциты сосудов, лимфоциты, трофобласты и нейтрофилы [9, 25].

ММП-7, также известная как матрилизин-1, относится к группе желатиназ и в основном разрушает несколько типов коллагенов (III, IV, V, IX, X, XI ), протеогликаны, фибронектин, эластин и казеин [9, 25]. В первом триместре ММП-7 экспрессируется в децидуальной оболочке и трофобласте, а также в NK-клетках матки и макрофагах, обеспечивая таким образом дальнейший рост и ремоделирование матки и плаценты [26]. Также в исследовании Reister с соавт. [27] было показано, что экспрессия ММП-7 была снижена в клетках вневорсинчатого трофобласта у женщин с ЗРП в сочетании с преэклампсией. При этом стоить отметить, что по результатам нашего исследовании референсный аллель Т rs11568818 MMP-7, являющийся фактором риска рождения маловесных детей, также связан со снижением уровня экспрессии мРНК в легких, печени, скелетной мускулатуре (по данным GTEx Portal).

По данным ряда полногеномных и ассоциативных исследований аллель Т rs11568818 MMP-7 также является фактором риска ряда заболеваний, таких как рак предстательной железы [28, 29]; рак шейки матки [30].

Заключение. Таким образом, аллель Т полиморфизма rs11568818 гена MMP-7 является фактором риска рождения новорожденных с более низким весом. Данный полиморфный локус обладает важными функциональными эффектами. Он локализован в эволюционно-консервативном регионе, сайте связывания с регуляторными белками (TBP, CFOS, CJUN), регионе гиперчувствительности к ДНКазе, и сайте модифицированных гистонов, маркирующих энхансеры и промоторы в мезенхимальных и гемопоэтических стволовых клетках, клетках остеобластов, адипоцитов, клеточной линии фибробластов легких, различных отделов головного мозга, легких и др., определяет чувствительность ДНК к четырем факторам транскрипции (Foxa, GR, PLZF, Pou5f1), связан с уровнем экспрессии мРНК гена MMP-7 в легких, печени, скелетной мускулатуре

Информация о финансировании

Исследование выполнено при поддержке гранта НИУ «БелГУ» 2023 г. «Молодые лидеры в науке».