Введение. Старение – эволюционно детерминированный длительный биологический процесс, приводящий к снижению функциональных возможностей организма [1]. Существует две принципиально отличных концепции для обоснования всего множества теорий старения: 1) накопление стохастических повреждений жизненно-важных молекул ДНК, РНК, протеинов и общее изнашивание организма, либо 2) наличие генетически детерминированной программы, неизбежно приводящей к возрастным изменениям и смерти [2]. С увеличением продолжительности жизни в обществе повышается количество хронических заболеваний. Наиболее распространенными являются болезни системы кровообращения, обусловленные изменением архитектоники стенок артерий и формированием атеросклеротических бляшек; органов зрения (развитие катаракты, глаукомы, нарушений рефракции); нервной системы и психические расстройства, особенно возникающие в результате нейродегенерации; опорно-двигательного аппарата, связанные с уменьшением плотности костной ткани и снижением мышечной массы; органов пищеварения; новообразования, а также нарушения обмена веществ, в частности сахарный диабет [3].

В ряде экспериментов было показано, что у небольшой пресноводной тропической рыбы зебраданио (Danio rerio, Zebrafish) развиваются девять известных для человека признаков физиологического старения организма: нестабильность генома, укорочение теломер, эпигенетические нарушения, изменение протеостаза, снижение чувствительности к питательным веществам, митохондриальная дисфункция, клеточное старение, истощение стволовых клеток и нарушение межклеточной коммуникации [4]. В последнее время зебраданио все чаще используется как объект для проведения доклинических испытаний [5]. Половозрелость особей наступает в 5-8 месяцев, срок жизни этих рыб в лабораторных условиях по разным данным составляет от 3 до 5 лет. Животные неприхотливы, для их содержания требуются минимальные затраты. Области исследования данного модельного объекта чрезвычайно разнообразны, в том числе определение острой токсичности на эмбрионах и взрослых особях [6, 7], скрининг нейроспецифических химических веществ [8, 9, 10], модели для создания транспортных лекарственных систем [11], генетические исследования [12], а также изучение возрастных заболеваний [13, 14, 15]. Согласно концепции «3R» многие страны снижают интенсивность тестирования химических субстанций на приматах и грызунах. Применение в доклинических исследованиях лекарственных средств рыб позволяет заменить выскоорганизованных животных более низкоорганизованными при этом существенно снизить затраты. За рубежом зебраданио в качестве модельных объектов используют достаточно давно, в последние годы отмечается интенсивное внедрение данной биомодели с целью оптимизации доклинических исследований и в России [16-19] Ограничениями в использовании зебраданио могут являться 10-15% различий в таргетах и только 70% генетической гомологии с человеком, дупликация 25% генов, иная, в отличие от теплокровных, фармакокинетика, относительно небольшой исторический опыт применения рыб в биомедицине.

Цель исследования. Провести анализ литературных данных о возможности и валидности использования модельного объекта зебраданио для изучения возраст-ассоциированных заболеваний.

Материалы и методы исследования. Были проанализированы научные работы, находящиеся в открытом доступе в базах данных PubMed, Web of Science, Elibrary и Google Scholar. Преимущественно изучались публикации на английском языке и размещенные в течение последних 5 лет, особое внимание уделялось оригинальным статьям.

Результаты и их обсуждение

Старение и сахарный диабет

С возрастом у людей повышается риск развития сахарного диабета второго типа (СД2). Как осложнение СД2, часто обнаруживается нарушение функции почек, микроциркуляторные патологии, приводящие к инфарктам и инсультам, изменение когнитивных функций, возможно возникновение гипогликемических состояний [20]. Использование зебраданио для моделирования сахарного диабета обусловлено сходством с млекопитающими строения поджелудочной железы, механизмом регуляции уровня глюкозы в крови [21]. При этом у всех костистых рыб обнаружены β-клетки, которые сходятся в центральной области поджелудочной железы, соответствующей островку Лангерганса человека, а также инсулин, который гомологичен человеческому и вырабатывается в количествах, эквивалентных таковым у людей [22].

Недорогими и широкодоступными являются методы экспериментального моделирования сахарного диабета у зебраданио, например, с помощью добавления моногидрата глюкозы в аквариум с рыбами. В результате экспериментов у рыб, обработанных глюкозой, обнаружено повышение концентрации сахара в крови натощак и резистентности к инсулину, повышался индекс массы тела, увеличивался уровень аспартатаминотрансферазы и щелочной фосфатазы, уменьшался диаметр ворсинок кишечника. Коррекция метформином и силимарином показывала положительный эффект [23]. В ряде других исследований с модификацией концентрации глюкозы и длительности погружения рыб в резервуар с углеводом также были обнаружены признаки гипергликемии, нарушение функции зрительного анализатора и когнитивные расстройства [24-27].

При введении стрептозотоцина взрослым рыбам внутрибрюшинно наблюдалось устойчивое гипергликемическое состояние (повышение уровня глюкозы натощак, увеличение содержания гликированных белков сыворотки крови). Микроскопическое исследование поджелудочной железы показало снижение сигнала инсулина у зебраданио с гипергликемией при иммуногистохимическом окрашивании. Также были отмечены ранние признаки ретинопатии (истончение сетчатки) и нефропатии (утолщение гломерулярной базальной мембраны). При ампутации хвостового плавника наблюдались серьезные нарушения регенерации в группе животных с гипергликемией по сравнению с контролем [28].

Известно, что инсулин и инсулиноподобный фактор роста (ИФР) работают в единой системе, регулирующей метаболизм, процессы роста и дифференцировки клеток. Низкая концентрация ИФР в крови может являться одной из причин прогрессирования диабетической кардиомиопатии, развития артериальной гипертензии, нарушения процессов регенерации [29]. У старых рыб во всех трех генах, связанных с путями передачи сигнала от инсулиноподобного фактора роста (IGF); IGF1, IGF2BP3 и IGFBP2A, исследователи наблюдали значительное снижение экспрессии, причем у самцов она была наиболее выражена у гена IGF1 [30].

По сравнению с фармакологическими моделями, генетические методы моделирования заболевания являются более точными и специфичными. Например, ген, кодирующий фактор транскрипции, участвующий в развитии поджелудочной железы (PDX1, по-другому - фактор-промотор инсулина 1, IPF1) играет важную роль как в процессе ее формирования, так и при функционировании зрелых бета-клеток. Мутации с частичной потерей функции увеличивают риск развития СД2. У зебраданио PDX1 экспрессируется в клетках-предшественниках поджелудочной железы и в зрелых бета-клетках поддерживается его экспрессия. Гомозиготы с нулевой мутацией в PDX1 доживают до зрелого возраста, но показывают сниженную жизнеспособность и маленький размер по сравнению с рыбами дикого типа. При анализе фенотипа поджелудочной железы отмечается снижение количества бета-клеток и уровня инсулина, дифференцировка ацинусов нарушается. Отмечается, что стойко повышенный уровень глюкозы у мутантов PDX1 реагирует на лечение противодиабетическими препаратами [31].

Возрастные заболевания глаз

Среди офтальмологических заболеваний у людей престарелого возраста наиболее широко распространены аномалии рефракции, возрастная макулярная дегенерация, катаракта, глаукома, диабетическая ретинопатия, в основе которых лежит множество молекулярных и клеточных механизмов [32]. Размер глаз рыбы достаточно велик относительно ее небольшого тела, что позволяет манипулировать их зачатками уже на ранних стадиях эмбриогенеза. Хотя сеть трабекул и динамика изменения водянистой влаги у зебраданио сильно отличаются от человеческой, общее сходство в среднем внутриглазном давлении и структуре тканей, обеспечивающих отток водянистой влаги, делает их отличной моделью для исследования генетики глаукомы человека. Остроту зрения рыб обычно оценивают в поведенческих тестах, исследуется оптокинетическая реакция и оптомоторный эффект [33].

С клинической точки зрения, различают возрастную и врожденную катаракту. Использование модели данного заболевания у зебраданио в основном фокусируется на врожденной форме, однако их можно использовать как инструмент для исследования механизмов возраст-ассоциированной катаракты, связанной с нарушением содержания кристаллинов – основных белков, входящих в состав хрусталика. Выявлено, что к помутнению хрусталика, вызванному активацией передачи сигналов глюкокортикоидными рецепторами, приводит мутация гена CRYAB, кодирующего αВ-кристаллин. В экспериментах использовали мутантные линии зебраданио с потерей функции гена, полученные при помощи системы CRISPR/Cas9 [34]. Показано, что мутация в гене CRYGC (кодирует γС-кристаллин), вызванная заменой глицина цистеином в кодоне 129 у рыб зебраданио, снижает термостабильность γС-кристаллина и повышает риск помутнения хрусталика при воздействии высоких температур и УФ-излучения, что в конечном итоге приводит к катаракте [35].

Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) – заболевание, вызывающее потерю зрения у людей старше 50 лет за счет дегенеративных изменений центрального отдела сетчатки. Одна из форм - сухая макулодистрофия, для которой характерно накопление продуктов обмена в области макулы и медленное развитие атрофии пигментного эпителия без признаков отека. Другая форма возникает, когда наряду с атрофией в слое хориокапилляров продолжается ангиогенез, она носит название «влажная» или неоваскулярная ВМД [36]. Трансгенная сверхэкспрессия человеческого HTRA1 - гена сериновой протеазы, определяющей степень васкуляризации тканей при взаимодействии с трансформирующим фактором роста бета, у зебраданио демонстрирует определенные морфологические изменения пигментного эпителия сетчатки, гибель фоторецепторных клеток и накопление липофусцина, которые являются признаками ранней макулодистрофии [37]. В ряде исследований представлена модель ретинопатии у зебраданио, вызванная гипоксией (содержание в резервуаре с низким уровнем кислорода в течение 3-10 дней), которую можно использовать для изучения «влажной» формы ВМД [38, 39]. Мутантная линия RP1L1, полученная редактированием генома рыб системой CRISPR/Cas9, используется для моделирования дегенерации фоторецепторов с отложениями субретинальных продуктов метаболизма клеток пигментного эпителия, что является отличительным признаком сухой формы макулодистрофии [14].

Мутанты PDX1 у рыб зебраданио представляют собой единственную известную модель для изучения ангиогенеза сетчатки, индуцированного экспериментальной гипергликемией [13]. Мутанты PDX1 имеют не только сосудистые, но и нейроретинальные нарушения, проявляющиеся дисфункцией и потерей фоторецепторов, сходные с диабетической ретинопатией человека [40].

Сердечно-сосудистые заболевания

Основными причинами смертности и инвалидизации людей после 60 лет являются болезни системы кровообращения (атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, аритмии, и др.) [41]. Работа двухкамерного сердца рыб аналогичная таковой у млекопитающих, структура может быть легко визуализирована, манипуляции возможны in vivo (у развивающихся эмбрионов) и in situ (в изолированных сердцах) [42]. Исследование микроструктуры сердца у зебраданио проводится с использованием стандартных методик гистологического окрашивания препаратов. Функциональная диагностика сердечно-сосудистой системы осуществляется с помощью ЭХО-кардиографического исследования [43] и регистрации ЭКГ у особей, анестезированных метансульфонат трикаином [44].

У пожилых зебраданио были описаны гипертрофия кардиомиоцитов, увеличение плотности миокарда желудочков с одновременным увеличением содержания коллагена, фиброзное поражение клапанов, отек перикарда и сокращение коронарной сосудистой сети [45]. В экспериментах показано, что у старых рыб отмечается увеличение толщины и плотности миокарда желудочка, содержания коллагена и фиброзной ткани; уменьшение диаметра просвета эпикардиальных сосудов (что является свидетельством снижения перфузии ткани миокарда); увеличение конечных диастолических размеров желудочка; удлинение времени изоволюмического расслабления миокарда; увеличение времени деполяризации предсердий и атриовентрикулярного узла (на что указывает увеличение интервала PR на ЭКГ); снижение скорости кровотока через желудочек. Гиперэкспрессия сердечных фетальных генов натрийуретического фактора – NPPA и NPPB, обнаруженных с помощью анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР), наблюдалась у рыб старшего возраста по сравнению с младшей группой [15].

Экспериментально установлено, что у зебраданио при физиологическом старении частота сердечных сокращений, реакция на стимуляцию блуждающего нерва снижены по сравнению с группой контроля, что свидетельствует о возрастных изменениях функции синоатриального узла. Эти изменения сопровождаются различиями во внутрисердечной иннервации, обусловленные возрастом, при этом общее количество и доля холинергических нейронов выше у пожилых животных [46].

Анализ длины теломер в сердечной ткани старых рыб после стрессового воздействия с использованием количественной ПЦР в реальном времени показал снижение длины теломер у животных с высокой стресс-реактивностью вне зависимости от пола. К возможному механизму, объясняющему это явление, можно отнести повышенную реактивность гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси у старых зебраданио [47].

Повышенный уровень холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в плазме крови является одним из главных факторов риска развития атеросклероза, приводящих к патологиям сердца и сосудов [48]. Нокаут гена рецептора ЛПНП у зебраданио приводит к гиперхолестеринемии, накоплению отложений липидов в сосудах, показатели повышаются при добавлении в рацион рыб корма с высоким содержанием холестерина. Использование ломитапида – ингибитора микросомального белка-транспортера триглицеридов – приводит к снижению количества холестериновых бляшек на стенках сосудов у нокаутных рыб [49].

Изменения опорно-двигательного аппарата, связанные с возрастом

Наиболее распространенным заболеванием опорно-двигательной системы у пожилых людей является остеопороз, приводящий к высокому риску переломов и деформации костей в связи с уменьшением количества костной ткани [50].

Взрослая рыба зебраданио представляет собой новый и легкодоступный ресурс для изучения регуляторных механизмов метаболизма костей взрослого человека на клеточном и молекулярном уровнях, а также патогенеза заболеваний костей или костных осложнений болезней человека. При общей морфологической оценке рыб при физиологическом старении отмечено прогрессирующее увеличение частоты и тяжести искривлений позвоночника. Рентгенографическое исследование в местах смещения позвоночного столба выявило частичный или полный вывих позвонка и очаговое утолщение кости по периферии сустава. Микроскопическое исследование скелета трехлетних рыб показало широко распространенные морфологические признаки эрозии кости, образования складок и ремоделирования ткани внутри позвонков; однако при оценке минеральной плотности кости не наблюдалось проявлений остеопороза [51]. Фенотип, подобный остеопорозу, связан с метаболическими изменениями, что позволяет предположить, что костные осложнения имеют одни и те же механизмы у людей и рыб [52].

Чешуя и плавники зебраданио являются частью кожного скелета, они содержат минерализованный матрикс и могут быть использованы для быстрой оценки формирования костей и отложений минеральных веществ [53]. Кроме того, эти элементы обладают способностью к регенерации, что позволяет определить молекулярный профиль остеобластов при восстановлении структуры [54].

Имеются данные, что избыточное накопление железа может нарушить баланс костного метаболизма и вызвать дефекты в процессе формирования кости [55]. Разработана также модель остеопороза на эмбрионах и взрослых рыбах с применением цитрата аммиачного железа (ferric ammonium citrate, FAC) путем добавления его в аквариум в концентрации 500 мкг/мл. Были исследованы такие параметры, как кальцификация костей (окрашивание ализариновым красным), развитие хрящей (окраска препаратов ацилановым синим) и уровни экспрессии генов, связанных с остеобластами. Обнаружено, что ускоренное старение, вызванное FAC, индуцирует фенотип остеопороза, о чем свидетельствует снижение минерализации, а также плотности костной ткани, развитие дефектов хрящей. Патологические изменения поддаются коррекции аллендронатом. Также было обнаружено снижение уровня мРНК генов, специфически экспрессируемых в остеобластах и хрящах [56].

У людей рецессивные мутации, приводящие к потере функции гена LRP5, трансмембранного липопротеинового рецептора, корецептора сигнального пути Wnt, вызывают синдром остеопороза-псевдоглиомы, обусловленный нарушением дифференцировки остеобластов [57]. Кроме того, в исследовании ассоциаций на уровне всего генома LRP5 был идентифицирован как основной локус риска фенотипов, связанных с остеопорозом [58]. Личинки зебраданио с нокаутом LRP5 в раннем эмбриогенезе проявляют сниженную минерализацию хорды и пороки развития головного хряща. У взрослых особей мутантной линии наблюдается снижение сигнальной активности Wnt при регенерации плавников [59].

Деформация костей в концевых пластинах позвоночника зебраданио во время естественного старения может привести к ложному повышению минеральной плотности костной ткани, что наблюдается у людей с дегенеративными изменениями поясничного отдела позвоночника. Были проведены эксперименты по изучению заболевания межпозвоночных дисков на зебраданио, которые моделировались путем мутации в генах SP7 (остерикс, связан с остеодифференцировкой) и CTSK (кодирует цистеиновую протеазу, участвующую в ремоделировании костей и их деградации), что приводило к низкой и высокой минеральной плотности костной ткани соответственно. В результате было выявлено, что элементы дисков повторяли симптомы болезни межпозвоночных дисков, обнаруживаемые у людей: в межпозвоночной связке (эквивалент фиброзного кольца человека) обнаружены дезорганизованные коллагеновые волокна и грыжа, тогда как в центре диска (эквивалент пульпозного ядра) наблюдалась дегидратация и клеточные аномалии. В экспериментах использовалось 3D-изображение с высоким разрешением (<0,1 мкм, синхротронное излучение), при этом была определена роль транскрипционного фактора SP7 в управлении 3D-профилем лакун остеоцитов [60].

У рыб при физиологическом старении наблюдается повышенное число спонтанных переломов плавников, которые легко обнаружить по наличию мозолей. В исследованиях общегеномных ассоциаций человека показано, что белок Wnt16 связан с хрупкостью костей и остеопорозом. Проводились эксперименты по динамическому изучению его влияния на кости мутантных особей зебраданио, лишенных Wnt16 (wnt16 -/-), которые демонстрируют переменную минеральную плотность тканей и были подвержены спонтанным переломам в лепидотрихиях хвостовых плавников и накоплению костных мозолей в раннем возрасте. Минерализация кости и рекрутирование остеобластов во время заживления переломов также значительно замедлены у мутантов Wnt16 [61].

У пожилых людей снижение физической работоспособности можно объяснить развитием саркопении. Уменьшение мышечной массы, силы приводит к снижению функциональных возможностей, частым падениям, инвалидизации [62]. В качестве способа коррекции данной патологии возможно применение физических упражнений. Эксперименты по изучению влияния двигательной нагрузки на скелетно-мышечную систему зебраданио с помощью теста интенсивного принудительного плавания – по 6 часов в день 5 дней в неделю в течение 2 недель, затем по 2-3 часа в день 5 дней в неделю в течение 2 недель показали, что принудительные физические нагрузки у рыб увеличивают массу скелетных мышц в зависимости от количества упражнений. Наблюдалась гипертрофия соматической мускулатуры без повышения массы тела, причем масса красных мышечных волокон росла при малом количестве упражнений, а белых - по мере роста интенсивности нагрузки. При увеличении количества упражнений отмечалось повышение уровня экспрессии генов PGC1α,NRF1 и CS, это является свидетельством возможности стимуляции физическими нагрузками защитных сил против старения на суборганизменном уровне [63]. Применение повышенных физических нагрузок при плавании зебраданио в тоннеле стимулирует рост костеобразующих остеобластов, объема кости и минерализации [64].

При протеомном исследовании хронологического старения мышц у женщин в постменопаузе выявлено три дифференциально регулируемых белка: карбоангидраза 2 (CA2), регуляторная легкая цепь миозина 2 (MYL2) и селенсвязывающий белок 1 (SELENBP1). В экспериментах изучались характеристики, пространственно-временные и возрастные профили экспрессии этих генов на разных стадиях жизни зебраданио. Гены СA2 в основном экспрессируется в глазу, головном мозге, кишечнике и жабрах, MYL2A и MYL2B, главным образом, в мышцах, жабрах, глазу и сердце, и SELENBP1 наиболее интенсивно экспрессируются в печени. Показано, что профиль их экспрессии изменяется с возрастом и может быть использован в качестве биомаркеров старения [65].

Нейродегенеративные заболевания

Подавляющее большинство нейродегенеративных заболеваний у человека обусловлены возрастом. Они возникают в результате прогрессирующей дегенерации и гибели нейронов, входящих в определенные структуры головного мозга, при этом нарушается взаимодействие между отделами ЦНС, связанное с дисбалансом конкретных нейромедиаторов и, как следствие, наблюдаются когнитивные отклонения, дефекты речи и т.д. [66]

Зебраданио традиционно используются для изучения нейродегенеративных заболеваний и процессов старения мозга. При проведении иммуноблоттинга экстрактов ткани мозга у зебраданио разного возраста с определением содержания белков, участвующих в синаптической передаче и являющихся маркерами целостности возбуждающих и тормозных синапсов: синаптофизина (SYP), белка PSD-95 и гефирина (GEP), было обнаружено, что PSD-95 значительно повышался у пожилых самок при физиологическом старении, SYP существенно снижался у самцов, а содержание GEP не изменялось [67]. Гены ACHE (ацетилхолинэстераза), PPARGC1B (коактиватор 1a рецептора, активируемого пролифераторами пероксисом типа b) демонстрируют значительное снижение при физиологическом старении. Предполагается, что во время старения снижается активность холинергической системы, поэтому снижается экспрессия гена ACHE, наблюдается нарушение когнитивных функций [30].

Болезнь Альцгеймера (БА) – хроническое нейродегенеративное заболевание, характеризующееся деменцией, дезориентацией, перепадами настроения, спутанной речью и неспособностью к координации движений; при этом отмечается высокий риск развития остеопороза и мышечной атрофии [68]. Одним из важных факторов развития деменции, является неумеренное снижение уровня ацетилхолина (ACh), гидролизуемого ацетилхолинэстеразой в головном мозге пациентов с БА [69]. В большинстве случаев БА обусловлена мутациями в белке-предшественнике β-амилоида (APP) и в пресенилинах 1 и 2, которые усиливают образование β-амилоида, обычно откладывающегося в виде сенильных бляшках в паренхиме головного мозга и церебральных сосудов. Другим важным морфологическим признаком БА является отложения нейрофибриллярных клубков из гиперфосфорилированного тау-белка, которые приводят к потере синаптических и нейронных связей [70, 71]. Моделирование БА у рыб осуществлялось в условиях ускоренного старения, выванного окадаиковой кислотой (OKA). Ее Na-соль растворяли в 95% спирте и разбавляли до конечной концентрации, использовали несколько вариантов: 10 Нм, 100 Нм, 500 Нм или 1 мкМ. Рыб помещали в раствор заданной концентрации. Были зафиксированы основные морфологические признаки исследуемой патологии в мозге: скопления β-амилоида, тау-белка и микрокровотечения, возникающие на поздних стадиях БА. Изменения также были связаны с дефицитом обучения и памяти, которые изучали в различных тестах через 9 дней после помещения в раствор с ОКА [72].

Изучалось влияния ройфолина – флавонового гликозида, относящегося к семейству апигенинов, на когнитивные функции зебраданио с экспериментальной БА. Моделирование осуществлялось с использованием скополамина, который может вызывать нарушение памяти и когнитивных функций за счет блокады мускариновых ацетилхолиновых рецепторов. Раствор вещества концентрацией 100 µM готовили в 2 л дистиллированной воды. За 30 мин до проведения поведенческих тестов рыбу помещали в стакан объемом 0,5 л на 30 минут. Изучали характер плавания рыб, поведение в Y-образном лабиринте, производительность памяти в тесте на распознавание объектов. В гомогенате мозга оценивали концентрацию ацетилхолинэстеразы, супероксиддисмутазы, каталазы, глутатионпероксидазы, а также уровня карбонилов белков и малонового диальдегида. Применение скополамина вызывало устойчивый анксиогенный ответ у рыб в поведенческих тестах и амнезию, биохимический анализ гомогенатов головного мозга показал высокую концентрацию маркеров окислительного стресса. В группах животных, получавших препарат, отмечался антиоксидантный, анксиолитический эффекты, снижение дефицита памяти [73].

У зебраданио обнаружены гены ортологи и коортологи человека, которые играют важную роль в патогенезе БА. Так, известны psen1, psen2 ортологи человеческих PSEN1 и PSEN2; bace1 и bace2 -BACE1 и BACE2 (β-секретазы) соответственно. Гены appa и appb являются “коортологами” человеческого APP (ген белка-предшественника бета-амилоида), а mapta и maptb-тау-белка, ассоциированного с микротрубочками (MAPT). Также выявлены ортологические компоненты гамма-секретазного комплекса PSENEN, NCTN, APH1b [74].

Болезнь Паркинсона (БП) – хроническое прогрессирующее заболевание головного мозга, характеризующееся дегенерацией и гибелью дофаминергических нейронов нигростриарной системы, агрегацией нерастворимых SNCA-фибрилл гена синуклеина (SNCA) и образованием телец Леви в черной субстанции, приводящее к нарушению функционирования базальных ганглиев. Заболевание может быть, как спорадическим, так и семейным и клинически проявляет себя по-разному [75, 76].

Патогенез спорадической БП связывают с нейротоксинами, такими как 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP) и пестицидами - ротеноном, паракватом.

MPTP превращается в 1-метил-4-фенилпиридиний (MPP+) моноаминоксидазой В в головном мозге, и этот метаболит приводит к гибели дофаминергических нейронов Substantia nigra путем ингибирования комплекса 1 дыхательной цепи митохондрий, что в конечном итоге приводит к гибели клетки [77]. Проводились исследования на зебраданио по моделированию болезни Паркинсона с применением указанного токсина. Перед введением MPTP взрослых рыб анестезировали 0,1% триканом внутрибрюшинно, далее вводили MPTP внутрибрюшинно одну или две дозы раздельно: 1 доза (50 г) и 2 дозы (2×50 г) MPTP в 5 л стерильной воды. Временной интервал между двумя дозами составлял 24 часа. Контрольным рыбам вводили физиологический раствор. Обработанные MPTP зебрафиш демонстрировали снижение подвижности при плавании, увеличение эпизодов замирания, что соответствует фенотипу болезни. Понижающая регуляция белков NEFL (легкие цепи нейрофиламентов) в мозге зебраданио, обработанных MPTP, связана с сигнализацией рецептора ГАМК-В в пресинаптических нервных окончаниях, участвует в ингибировании секреции нейромедиатора в пресинаптических глутаматергических и ГАМКергических нервных окончаниях. На основании вестерн-блот-анализа было обнаружено, что экспрессия гена SNCGA/B (ортолог человеческого синуклеина гамма 1 и 2) незначительно повышалась при лечении двойной дозой MPTP. Аналогично на основе иммунофлуоресцентного анализа в области тектума зрительного нерва, высокий уровень экспрессии гена SNCGA/B наблюдался у зебраданио, обработанных MPTP [78].

При воздействии MPTP у рыб происходит нарушение двигательных функций, выражающееся в снижении скорости плавания, и аберрантное поведение, что похоже на симптомы брадикинезии у человека. Также рыбы проводят больше времени на дне аквариума, и увеличивается количество эпизодов замирания, что свидетельствует о значительном снижении двигательной активности. Кроме того, MPTP ослабляет сенсорную чувствительность [79].

Ротенон (ROT) – изофлавоноид растительного происхождения является антагонистом дофаминергических нейронов, способен проникать через гематоэнцефалический барьер и накапливаться в органоидах, преимущественно в митохондриях. Он уменьшает продукцию АТФ и повышает образование активных форм кислорода за счет ингибирования комплекса I митохондриальной цепи переноса электронов [80]. ROT вызывает активацию микроглии, отражающуюся нейровоспалением, и агрегацию α-синуклеина, приводящую к отложению телец Леви [81]. В экспериментах зебраданио подвергали хроническому воздействию ROT в течение 32 дней. Оценивали уровень агрессии и социальное поведение при вращении против часовой стрелки, в Т-образном лабиринте. Ротенон в эмпирически подобранной дозе 2,5 мкг/л растворяли в дистиллированной воде и вводили внутрь перед кормлением с использованием герметичного баллона объемом 100 мл. В результате выявили, что ротенон приводит к нарушению социального поведения и аномальному вращению против часовой стрелки [82].

Еще одна популярная модель БП обусловлена применением 6-гидроксидофамина (6-OHDA), который вызывает ускоренное старение, инициируя массовую антероградную дегенерацию клеток нигростриатальной системы мозга. Нейроны начинают отмирать в течение первых 12 ч после инъекции, выраженное поражение полосатых дофаминергических окончаний, сопровождающееся истощением дофамина, устанавливается в течение 2-3 дней [83]. В экспериментах по изучению влияния метанольного экстракта рожкового дерева (Ceratonia siliqua) на ухудшение памяти и окислительный стресс у зебраданио моделирование БП осуществлялось при помещении рыб на 60 минут в аквариум, содержащий 160 µM 6-ОHDА. Отмечалось предотвращение дефицита кратковременной памяти в экспериментальной группе и антиоксидантный эффект [84]. Также в исследованиях используется аналогичная модель с модификацией концентрации 6-OHDA 250 µM [85].

Другой способ введения 6-гидроксидофамина – интрацеребровентрикулярная микроинъекция 99,96 mM нейротоксина рыбам через вентральную часть промежуточного мозга. В результате иммунофлуоресцентного анализа было выявлено, что 85% дофаминэргических нейронов погибло, полное восстановление происходило на 30-й день после вмешательства. После инъекции у зебраданио отмечалось нарушение локомоции, выражающееся в снижении скорости и пройденного расстояния в аквариуме [86].

Заключение. Старение – закономерный физиологический процесс, создающий предпосылки для развития заболеваний, ассоциированных с возрастом. Рыбы зебраданио являются универсальным модельным объектом для изучения таких заболеваний человека и тестирования потенциальных терапевтических средств. Содержание малозатратно, половой зрелости достигают быстро, а в лаборатории могут прожить от 3 до 5 лет. Постепенно ученые перестают проводить эксперименты на грызунах, следуя концепции «3R». Применение рыб в качестве модельных объектов заменяет более высокоорганизованных млекопитающих. Исследователи используют как фармакологические, так и генетические модели, полученные путем нокаута конкретного гена, его сверхэкспрессии или мутации. В экспериментах на рыбах исследуются такие заболевания, ассоциированные с возрастом, как сахарный диабет 2 типа, возрастная макулярная дегенерация, катаракта, атеросклероз, фиброз клапанов сердца, нарушение сердечной деятельности, остеопороз, нарушение костного метаболизма, саркопения, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Сходство строения органов, физиологических процессов, метаболитов, гормонов, нейромедиаторов у рыб с млекопитающими позволяет проводить поведенческие, функциональные, микроскопические, биохимические, генетические исследования. Однако в настоящее время отсутствуют стандарты использования зебраданио в доклинических исследованиях лекарственных средств. Применение данной биомодели для оценки эффективности и безопасности химических субстанций возможно лишь при надлежащей валидизации и получении одобрения от соответствующих организаций^[1]. Несмотря на ряд ограничений представляется перспективным и стратегически важным использовать зебраданио на доклиническом этапе изучения эффектов лекарственных препаратов для коррекции возраст-ассоциированных заболеваний с целью улучшения качества жизни пожилого человека и, в случае получения успешных результатов, данный модельный объект может быть включен в качестве дополнительного в национальные стандарты.

Информация о финансировании

Финансирование данной работы не проводилось