Введение. Недостаточный рост плода (НРП) представляет собой осложненное течение беременности, при котором показатели физического развития плода не достигают установленных норм, соответствующих сроку гестации. Данное состояние определяется посредством ультразвукового обследования. В соответствии с актуальными клиническими рекомендациями 2025 года, выделяют две клинические вариации НРП. К ним относятся задержка роста плода (ЗРП) и малый/маловесный для гестационного возраста плод (МГВ). Эти формы отличаются разными показателями отставания физических параметров плода, а также наличием или отсутствием нарушений кровотока, определяемых с помощью ультразвуковой допплерографии [1, 2]. Известно, что данная патология осложняет течение беременности в 10-25% случаев, определяя порой показания для досрочного родоразрешения, что усугубляет долгосрочные неблагоприятные последствия для здоровья ребенка, увеличивая долю хронических заболеваний в зрелом возрасте [3, 4, 5].

НРП относится к многофакторным заболеваниям. Его развитие связывают с воздействием материнских, плацентарных, фетальных или генетических факторов [2, 6, 7]. При рассмотрении генетических факторов, приводящих к развитию НРП, выделяют наличие хромосомных аномалий (анеуплоидии, структурные аномалии хромосом); моногенных заболеваний; эпигенетических изменений [7, 8]. Так, известно, что трисомии по 13, 17, 18 хромосомам, помимо множественных врожденных пороков развития, зачастую сопровождаются ЗРП [9, 10]. Примерами структурных аномалий, которые могут приводить к НРП служит синдром кошачьего крика (делеция короткого плеча 5 хромосомы) и синдром Уильямса-Беремена (гетерозиготная делеция в районе хромосомы 7q11.23) [11, 12]. К развитию ранней (до 32 недели беременности) и тяжелой (предполагаемая масса плода менее 3-го процентиля) ЗРП могут приводить моногенные заболевания, наиболее частыми из которых являются синдром Сильвера-Рассела, синдром Нунан, ахондроплазия, синдром Мейера-Горлина [8].

Особый интерес вызывает изучение недостаточного роста у плода с нормальным каритотипом. Известно, что значимым фактором аномального роста и развития плода может являться изменение экспрессии генов в плаценте [6]. Количество работ, изучающих генетические аспекты плацентарной недостаточности при НРП не так обширно, и в основном они затрагивают изучение полиморфных маркеров генов фолатного цикла, провоспалительных цитокинов, факторов коагуляции, матриксных металлопротеиназ [13-16].

Важную роль в нормальном течении беременности, росте плода и поддержании гомеостаза амниотической жидкости играют аквапорины (AQP) – интегральные протеины, формирующие водные каналы, избирательно пропускающие молекулы воды [17, 18]. AQP представляют собой повсеместно присутствующие белки в тканях организма, и их наличие в плаценте не является исключением: в ней экспрессируется семь различных подтипов AQP (1, 3, 4, 5, 8, 9 и 11), которые критически важны для нормального течения беременности, регуляции объема амниотической жидкости и адекватного развития плода [18, 19]. В настоящее время научные изыскания, посвященные роли AQP в развитии осложнений беременности, акцентируют внимание на их корреляции с изменениями объема амниотической жидкости. Будучи трансмембранными белками, AQP выполняют фундаментальную функцию в перемещении воды через эпителиальные клетки, выстилающие амниотическую полость. Изменения в уровнях экспрессии этих белков, а также их активность, могут влиять на секрецию и реабсорбцию амниотической жидкости, приводя к развитию многоводия или маловодия - состояний, ассоциированных с повышенным риском перинатальных осложнений [20, 21].

Работы, фокусирующиеся на роли аквапоринов при плацентарной недостаточности, пока немногочисленны, но уже демонстрируют их потенциальное значение. Так, к примеру, изменения в экспрессии AQP1 и AQP4 показали ассоциацию с такими осложнениями беременности, как преэклампсия и гестационный диабет [22, 23]. Эти состояния, как известно, могут также приводить к нарушению роста плода. Следовательно, можно предположить, что аналогичные молекулярные механизмы лежат в основе развития НРП, связанного с дисфункцией плацентарного транспорта воды.

Таким образом, представляет актуальность детальное изучение генетических детерминант различных типов аквапоринов, которые могут влиять на его экспрессию в плаценте у беременных с НРП, что позволить не только пролить свет на конкретные молекулярные пути, вовлеченные в развитие рассматриваемого осложнения беременности, но и стать основой для разработки новых диагностических маркеров и терапевтических стратегий в будущем, способствуя разработке персонализированного подхода к ведению беременности.

Цель исследования. Поиск ассоциаций полиморфных маркеров гена AQP1 с клиническими формами недостаточного роста плода.

Материалы и методы исследования. В настоящем исследовании было проанализировано 297 образцов ДНК от пациенток с одноплодной беременностью, наступившей в естественном цикле и завершившаяся рождением живого ребенка на сроке 24 недели и более. Сбор биологического материала осуществлялся на базе ОГАУЗ «Областной перинатальный центр им. И.Д. Евтушенко» в городе Томске. Участницы исследования были дифференцированы на две когорты. Пациентки, беременность которых была осложнена развитием недостаточного роста плода, составили основную группу (I). Данная группа была подразделена на две подгруппы. В подгруппу Ia были включены пациентки с антенатально выявленной задержкой роста плода (ЗРП) (n=80). Подгруппа Ib охватила пациенток, у которых беременность осложнилась развитием маловесного для гестационного возраста плода (МГВ) (n=67). Критерии диагностики ЗРП и МГВ соответствовали текущему клиническому протоколу [1, 24]. В контрольную (II) группу вошли пациентки, беременность которых завершилась рождением здорового доношенного новорожденного с нормальными росто-весовыми показателями (n=150). В контрольную (II) группу были включены женщины, чьи беременности закончились рождением доношенных новорожденных с нормальными антропометрическими показателями (n=150). Для определения соответствия параметров массы и роста новорожденных гестационной норме в постнатальном периоде использовались центильные таблицы INTERGROWTH-21. Этот подход был применен для подтверждения диагнозов ЗРП и МГВ, установленных во время беременности. Кроме того, данный метод позволил верифицировать нормальные показатели роста и веса у младенцев, включенных в контрольную группу [25].

Критерии включения и исключения из исследования были идентичны тем, что применялись нами в предыдущей работе [24]

В выборки основной и контрольной групп включались женщины русской национальности, проживающие на территории Томской области и не состоящие в родстве между собой.

У всех женщин предварительно было получено информированное согласие на участие в исследовании. Исследование одобрено этическим комитетом СибГМУ (№9330 от 30.01.2023 г).

Характеристика пациентов

Группы исследования были сопоставимы по возрасту, ИМТ, социальному статусу и семейному положению.

При анализе акушерского анамнеза установлено, что изучаемые осложнения гестации достоверно чаще встречалась в предыдущие беременности у групп пациенток ЗРП и МГВ, по сравнению с контролем (p_Ia-II<0,001 и p_Ib-II=0,006 соответсвенно). У 14,9% пациенток, относящихся к группе МГВ, в анамнезе были случаи преждевременных родов, что статистически значимо отличается от данных в группе контроля (p=0,011). При этом, в частоте встречаемости преэклампсии в анамнезе у женщин обеих групп существенных различий не обнаружено (табл. 1).

Молекулярно-генетическиеметоды

Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 8-9 мл, взятая из локтевой вены. ДНК экстрагировали из цельной венозной крови стандартным методом фенол-хлороформной экстракции. Генотипирование осуществляли методом MALDI-TOF масс-спектрометрии на платформе «Sequenom MassARRAY4». Экспериментальные исследования были выполнены на базе Центра коллективного пользования научно-исследовательским оборудованием ЦКП «Медицинская геномика» НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ.

Полиморфные маркеры были выбраны с помощью базы данных RegulomeDB [26]. В исследование включены полиморфные маркеры, для которых insilico был обнаружен коэффициент регуляторного потенциала равный 1 в отношении экспрессии гена AQP1, а также была получена возможность мультиплексного генотипирования методом масс-спектрометрии. В таблице 2 представлена характеристика полиморфных маркеров гена AQP1, включенных в анализ ассоциаций с НРП.

Согласно аннотации с использованием базы данных FAVOR, вариант rs10253374 характеризуется высоким уровнем эпигенетической активности (aPC = 17,9; топ 2%), что свидетельствует о его расположении в области активного хроматина, потенциально соответствующей энхансеру или промотору [27]. Кроме того, показатель активности транскрипционных факторов (aPC = 13,1; топ 5%) указывает на возможное участие данного варианта в регуляции связывания транскрипционных факторов. Высокое значение показателя aPC для микроРНК (99,5; топ 0,1%) может свидетельствовать о потенциальном влиянии на сайты взаимодействия с микроРНК, несмотря на интронную локализацию варианта. Полиморфизм rs4723022 также демонстрирует признаки регуляторной активности: показатель aPC для транскрипционных факторов составляет 10,0 (топ 10%), что указывает на его возможную локализацию в регуляторных участках ДНК. Аналогично rs10253374, данный вариант характеризуется высоким значением aPC для микроРНК (99,5), что предполагает потенциальное участие в посттранскрипционной регуляции. Анализ тканеспецифической активности показывает, что rs10253374 ассоциирован с эпигенетическими сигналами в клетках иммунной системы, головного мозга, лёгких (максимальный сигнал 5,5), а также нервной и соединительной тканей. В свою очередь, rs4723022 демонстрирует активность в иммунной системе, головном мозге, лёгких и мышечной ткани.

Согласно классификации RegulomeDB маркер rs10253374 обладает выраженным регуляторным потенциалом, так как полиморфизму присвоен ранг 1b (eQTL/caQTL + связывание транскрипционных факторов (TF) + любой мотив + след ДНКазы + пик ДНКазы) [27]. Данный вариант локализован в области сайта связывания с фактором транскрипции POLR2A (субъединица RPB1 ДНК-управляемой РНК-полимеразы II), являющейся ключевым элементом транскрипционного комплекса, обеспечивающим синтез мРНК и регуляцию экспрессии генов, участвующих в клеточном росте и дифференцировке. Данный вариант упоминается только в одном исследовании, где продемонстрирована возможная связь с ультрафильтрацией и транспортировкой мочевины у детей с перитонеальным диализом [28]

Маркер rs4723022 характеризуется ещё более высоким регуляторным потенциалом 1a (eQTL/caQTL + связывание транскрипционных факторов (TF) + соответствующий мотив TF + соответствующий след ДНКазы + пик ДНКазы) и локализован в области связывания транскрипционного фактора KLF1 (Kruppel-подобный фактор 1), являющимся главным регулятором образования эритроцитов и отвечающим за переключение синтеза гемоглобина с фетального на взрослый. Литературных данных, связанных с анализом этого SNP не обнаружено.

Дополнительно показано, что оба варианта ассоциированы с регуляцией длинной некодирующей РНК CARS1-DT (данные GTEx), что указывает на их возможное участие в регуляторных сетях экспрессии генов [29].

По данным базы RegulationSpotter, для rs4723022 выявлены слабые, но тканеспецифические эпигенетические сигналы, включая метки H3K4me1 и участки открытого хроматина, преимущественно в иммунных клетках и фетальных тканях (мышцы, кишечник). Особый интерес представляет наличие сигнала в клетках трофобласта (H1-trophoblast), что указывает на потенциальную функциональную активность данного варианта в плаценте [30].

Оба варианта являются распространёнными в популяциях, при этом данные о их клинической патогенности в настоящее время отсутствуют.

Таким образом, полиморфные варианты rs10253374 и rs4723022 гена AQP1 представляют собой некодирующие регуляторные SNP с высоким функциональным потенциалом. Совокупность данных (FAVOR, RegulomeDB, GTEx, RegulationSpotter) указывает на их участие в регуляции экспрессии генов на различных уровнях – от изменения доступности хроматина и связывания транскрипционных факторов до возможного влияния на посттранскрипционные механизмы через микроРНК и длинные некодирующие РНК.

Статистический анализ

Для оценки нормальности распределения количественных данных применялся критерий Колмогорова-Смирнова. Поскольку в данном исследовании распределение не соответствовало нормальному, количественные показатели были представлены в виде медианы и интерквартильного интервала (Ме (Q1; Q3)). Для определения различий между группами использовался непараметрический статистический метод – тест Манна-Уитни. Статистическая значимость различий устанавливалась при p<0,05.

Для анализа соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, рассчитанному по принципу равновесия Харди-Вайнберга, использовался критерий χ² Пирсона. Сравнение частот аллелей и генотипов в различных группах проводилось с помощью критерия χ² Пирсона с поправкой Йейтса. В ситуациях, когда ожидаемое количество наблюдений в любой ячейке таблицы сопряженности было менее 5, применялся двусторонний точный тест Фишера. Для исследования связи полиморфных маркеров с ЗРП и МГВ рассчитывалось отношение шансов (ОШ) с указанием его 95%-ного доверительного интервала (95% ДИ).

Статистический анализ производился при использовании статистических пакетов Excel, SPSS Statistics 26.

Результаты исследования. Анализ распределения генотипов по изучаемым полиморфным локусам rs10253374, rs4723022 гена AQP1 показал, что для всех локусов в исследуемых группах эмпирическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди–Вайнберга (p>0,05).

В ходе анализа распределения изучаемых полиморфных вариантов гена AQP1 у беременных группы недостаточного роста плода и контроля были выявлены значимые различия только для варианта rs4723022 (табл. 3). Наблюдается тенденция к повышению частоты аллеля С rs10253374 в группе НРП, однако это различие не было статистически значимо (p=0,05)

При детальном анализе распределения полиморфных маркеров rs10253374 и rs4723022 гена AQP1 в подгруппах Ia и Ib выявлена их ассоциация только с развитием ЗРП (табл. 4). У пациенток данной подгруппы показано, что для rs10253374 гена AQP1 рисковым является генотип СС (ОШ=2,210; 95% ДИ 1,208-4,044; p=0,015), рисковым выступает аллель С (χ²=6,444; p=0,012). Для rs4723022 гена AQP1 рисковым для ЗРП является генотип АА (ОШ=2,261; 95% ДИ 1,149- 4,450; p=0,026), рисковым выступает аллель А (χ²=6,215; p=0,013). Из изученных полиморфных маркеров гена AQP1 не выявлено ни одного аллельного варианта, ассоциированного с развитием маловесного для гестационного возраста плода.

Представляет интерес: не возрастает ли у пациенток вероятность развития ЗРП при сочетании двух рисковых генотипов полиморфных локусов rs10253374 и rs4723022 гена AQP1? Проведенный нами анализ выявил, что как изолированное наличие рисковых генотипов СС rs10253374 и АА rs4723022, так и их комбинация у пациенток сопряжены с равным риском развития ЗРП, не демонстрируя синергетического эффекта (ОШ=2,425; 95%ДИ 1,335-4,404; р= 0,006). Генотипические комбинации оказались информативными и для выделения сочетаний генотипов, обладающих протективными свойствами в отношении развития ЗРП: для TC rs10253374 и GA rs4723022 ОШ=0,368, р= 0,048 (табл. 5).

Дополнительно, мы провели поиск ассоциаций полиморфных вариантов гена AQP1 с диагностическими показателями программы Astraia (свободная β-субъединица хорионического гонадотропина человека, ассоциированный с беременностью плазменный белок А, пульсационный индекс в маточных артериях и среднее значение артериального давления), клиническими данными и лабораторными показателями первого триместра (уровень эритроцитов, гемоглобина, гематокрита, тромбоцитов в общем анализе крови; значения аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, глюкозы, креатинина, общего белка, общего билирубина, мочевины в биохимическом анализе крови, значения общего фибриногена, международного нормализованного отношения, активированного частичного тромбопластинового времени и протромбинового времени в свертывающей системе крови) беременных. Выявлена значимая ассоциация для rs4723022 у пациенток контрольной группы с риском ЗРП, рассчитанным в программе Astraia, при проведении комбинированного пренатального скрининга первого триместра (H = 9,815; p = 0,007). Обращает на себя внимание, что в контрольной группе медианные значения риска ЗРП в зависимости от генотипа AQP1 распределились следующим образом: для генотипа GA медиана риска составила 637, для генотипа AA – 456, а для генотипа GG – 205. Исследование полиморфных вариантов гена AQP1 в основной группе выявило статистически значимую ассоциацию rs4723022 с анамнезом пациенток, предыдущая беременность которых была осложнена развитием НРП. Анализ показал, что у данных пациенток генотип AA встречался в 100% случаев (χ2=8,192, р=0,017) (табл. 6). С остальными лабораторными данными первого триместра ассоциаций не выявлено.

Обсуждение. Ген AQP1 кодирует аквапорин-1 (AQP-1) – белок, принадлежащий к семейству водных каналов – аквапоринов, основная функция которых заключается в поддержании нормального объема амниотической жидкости во время беременности, путем регуляции транспорта воды через плазматическую мембрану клетки по осмотическому или гидростатическому градиентам [20]. Показано, что экспрессия AQP1 во время беременности происходит в основном в эпителии амниона и цитотрофобластах хориона [18]. Важно отметить, что данный белок единственный из семейства аквапоринов экспрессия которого происходит в эндотелиальных клетках, что предполагает его участие в ангиогенезе в качестве проангиогенного фактора [18, 19]. Представляют интерес результаты исследований опухолевых клеток, показавшие взаимосвязь между повышенной экспрессии AQP1 в клетках опухоли и усилением их пролиферативной и инвазивной активности, определяя неблагоприятный прогноз заболевания [17, 31, 32]. Учитывая представленную функциональную характеристику AQP1, можно предположить его вовлеченность этиопатогенез ЗРП на стадии формирования плаценты путем нарушения процессов ангиогенеза с последующим неадекватным ремоделированием спиральных артерий, дисбаланса между клеточной пролиферацией и апоптозом, снижения инвазивной способности клеток [33, 34]. Данная гипотеза находит подтверждение в экспериментальном исследовании на мышиных моделях, которое показало ингибирующее влияние гена AQP1 на развитие плаценты и плода у особей с нокаутом данного гена [35, 36].

При анализе оригинальных исследований мы не встретили работ, в которых рассматривается ассоциация гена AQP1 с ЗРП. Большое количество работ посвящено изучению связи гена AQP1 с объемом амниотической жидкости: так, Ding H. с соавторами установили значимую обратную корреляцию индекса амниотической жидкости и уровнем AQP1 в плаценте у пациенток с преэклампсией [37]. Эти результаты согласуются с данными другой работы, показавшей снижение уровня AQP1 в амниотической жидкости у пациенток с многоводием [21].

Можно предположить, что выявленные нами ассоциации полиморфных маркеров гена AQP1 участвуют в предрасположенности к ЗРП через развитие плацентарной недостаточности. Не исключено влияние AQP1 на изменение экспрессии других аквапоринов как в плаценте, так и в плодных оболочках (AQP-8, AQP-9) [38]. Однако, данные предположения, несомненно, требуют подтверждения дальнейшими исследованиями с увеличением объема выборки и использованием методов функциональной геномики.

Таким образом, AQP1 представляет собой перспективный объект для дальнейших исследований, углубленное изучение молекулярных механизмов которого позволит не только расширить функциональное значение AQP1 в развитии недостаточного роста плода, но и разработать стратегии, направленные на модуляцию его активности для улучшения исходов беременности.

Заключение. Результаты проведенного исследования впервые демонстрируют значимую ассоциацию полиморфных маркеров rs10253374 и rs4723022 гена AQP1 с развитием ЗРП: для rs10253374 рисковым является генотип СС, для rs4723022 рисковым выступает генотип АА, увеличивая шанс развития ЗРП в 2,210 и 2,261 соответственно. Анализ генотипических комбинаций позволил выявить не только рисковые сочетания генотипов (СС rs10253374 и АА rs4723022), но и генотипы обладающие протективными свойствами (TC rs10253374 и GA rs4723022). Не найдено ассоциаций полиморфных маркеров изучаемого гена с МГВ. В контрольной группе выявлена значимая ассоциация rs4723022 с риском ЗРП, рассчитанным в программе Astraia. Исследование полиморфных вариантов гена AQP1 в основной группе выявило статистически значимую ассоциацию rs4723022 с анамнезом пациенток, у которых предыдущая беременность была осложнена развитием НРП. Полученные результаты могут свидетельствовать о возможной роли изучаемого гена в формировании ЗРП, которая может быть реализована посредством изменения уровня экспрессии данного гена в плацентарной ткани.

Информация о финансировании

Исследование выполнено за счет средств государственного задания по теме ФНИ № 122020200083-8.