Введение. В настоящее время в мировой практике для лечения ишемических и реперфузионных повреждений сетчатки, включая диабетические и гипертонические ретинопатии, применяют сосудорасширяющие препараты, фибринолитики, антикоагулянты, ангиопротекторы, биогенные стимуляторы, витамины, иммуномодуляторы, антиоксиданты и другие лекарственные средства [4].

Лечение вышеперечисленными препаратами не всегда бывает достаточно успешным, что говорит о необходимости расширения арсенала лекарственных средств для лечения глазных болезней, связанных с ишемическими состояниями [6, 7, 8].

В связи с этим, профилактика и коррекция ишемических заболеваний сетчатки является актуальной проблемой современной офтальмологии и фармакологии, которую можно решить с помощью фармакологического прекондиционирования [3].

Прекондиционирование может рассматриваться как универсальный инструмент предупреждения ишемического повреждения тканей, что подтверждается многочисленными мировыми исследованиями. Суммированы доказательства того, что открытие митохондриальных К+АТФ каналов действует как ведущий механизм в феномене прекондиционирования [2].

Фармакологическое прекондиционирование никорандилом доказано на сердце [5], мочевом пузыре [10], печени [9], кожном лоскуте [1] и других органах.

Учитывая данные литературы и экспериментальных исследований по фармакологическому прекондиционированию, можно предположить, что введение никорандила лабораторным крысам будет оказывать протективный эффект на сетчатке при ишемическом повреждении.

Целью настоящего исследованияявлялось изучение влияния дистантного ишемического прекондиционирования (ДИП) и фармакологического прекондиционирования никорандилом на уровень микроциркуляции и гистоморфометрические изменения в сетчатке при моделировании ишемии-реперфузии глаза.

Материалы и методы. Опыты проведены на 70 беспородных обоеполых крысах массой 225-275 г. Моделирование ишемии-реперфузии сетчатки глаза проводили под наркозом (хлоралгидрат, 300 мг/кг массы тела животного, внутрибрюшинно) путем оказания механического давления (110 мм.рт.ст.) на переднюю камеру глаза в течение 30 минут. Подтверждением формирования ишемии служило отсутствие глазного кровотока.

Для изучения протективных свойств ДИП, фармакологического прекондиционирования никорандилом выполнено 7 серий эксперимента:

I (n=10) – группа интактных животных;

II (n=10) – с ишемией-реперфузией сетчатки (контроль);

III (n=10) – с коррекцией патологии ДИП;

IV (n=10) – с коррекцией никорандилом;

V (n=10) – контроль + глибенкламид (блокатор АТФ-зависимых калиевых каналов);

VI (n=10) – ДИП + глибенкламид ;

VII (n=10) – никорандил + глибенкламид;

ДИП проводили 10-минутным пережатием бедренной артерии путем наложения жгута на проксимальную треть бедра за 40 мин до моделирования ишемии сетчатки, после чего следовал 30-минутный эпизод реперфузии.

Для изучения прекондиционирующего эффекта никорандила в дозе 0,6 мг/кг использовали таблетки «Коронель» (ПИК-ФАРМА), содержащие 10 мг никорандила, которые измельчали в ступке, растворяли в крахмальном киселе и вводили животным через зонд внутрижелудочно за 30 мин до моделирования ишемии.

Глибенкламид («Манинил» (Берлин-Хеми АГ) вводили в дозе 5 мг/кг однократно за 60 мин до моделирования ишемии.

О выраженности протективного эффекта судили по изменению уровня микроциркуляции и гистоморфометрическим изменениям в сетчатке крыс через 72 часа реперфузии. Для этого под наркозом (хлоралгидрат, 300 мг/кг массы тела животного, внутрибрюшинно) животное фиксировали. Измерение уровня микроциркуляции в сетчатке крыс осуществляли с помощью лазер-доплер флоуметра Biopac-systems МР-150 и датчика TSD-l44 иглообразного типа (США). Для этого под наркозом животное фиксировали и производили регистрацию уровня микроциркуляции в сетчатке в 10 точках по окружности склеры с шагом 1 мм. Запись кривой уровня микроциркуляции проводили в течение 20 секунд в каждой точке. Из полученных десяти значений выводили среднее, которое вносили в протокол и принимали за уровень микроциркуляции в сетчатке у данного животного. Из 10 полученных значений выводили среднее, которое принимали за уровень микроциркуляции в сетчатке в данной группе животных.

Затем глазное яблоко подлежало энуклеации. Для гистологических исследований глаза с непосредственно прилегающими тканями фиксировали в 10% растворе формалина. После фиксации материал полностью заливали в стандартном режиме в парафин. Кусочки ориентировали в блоках таким образом, чтобы при изготовлении срезов получить препараты в меридианном направлении строго через середину глазного яблока. Срезы для стандартного гистологического исследования окрашивали гематоксилином и эозином. Описательное исследование гистологических препаратов выполняли под микроскопом Axio Scope A1 (Carl Zeiss Microimaging GMbH, Германия). Для морфометрии слоев сетчатки использовали программу ImageJ 1.47.

Достоверность изменений абсолютных параметров определяли разностным методом вариационной статистики с нахождением средних значений сдвигов, средней арифметической и вероятности возможной ошибки (р) по таблицам Стьюдента. Различия оценивали как достоверные при p<0,05.

Результаты и их обсуждение. Гемодинамические нарушения в системе ретинального кровотока через 72 ч реперфузии после моделирования патологии приводили к морфологическим изменениям в сетчатке, характерным для ишемии, что подтверждает адекватность выбранной модели патологии.

Уровень микроциркуляции в сетчатке интактных крыс составлял 743,9±5,0 перфузионных единиц (п.е.), в группе контроля данный показатель снижался в 2 раза и составил 353,3±11,7 п.е. (р<0,001), что свидетельствует о формировании повреждения сетчатки через 72 ч. реперфузии (таблица 1). На фоне коррекции патологии ДИП уровень микроциркуляции после 72 ч. реперфузии достоверно возрастает до 638,5±15,8 п.е. (р<0,05) по сравнению с группой контроля. При коррекции патологии сетчатки никорандилом уровень микроциркуляции в группе возрастает до 705,2±15,5 п.е., что достоверно отличается от значений в группе контроля (р<0,001) и стремится к значению в группе интактных животных. Введение глибенкламида в группах с коррекцией ишемических повреждений предотвращало увеличение уровня микроциркуляции, что подтверждает ключевую роль К+АТФазных каналов в формировании прекондиционирования.

Таблица 1

Изменение уровня микроциркуляции в сетчатке через 72 часа реперфузии (M±m; n=10)

Table 1

The change in the level of microcirculation in the retina after 72 hours of reperfusion (M±m; n=10)

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных;  у - р<0,05 в сравнении с группой контроля

Рис. 1. Микрофотографии слоев сетчатки крыс: А – гистологическая картина сетчатки интактных крыс. В – выраженные дегенеративные изменения по сравнению с сетчаткой интактных животных через 72 часа после ишемии-реперфузии. Дилатация и неравномерное кровенаполнение венозных сосудов на уровне хориоидеи (стрелка) в группе контрольных животных. Структурные изменения сетчатки в виде отечных изменений и разрыхления внутреннего ядерного слоя (двойная стрелка). Окр. гематоксилином и эозином. Микрофото х400.

Fig. 1. Microphotographs of the layers of the retina of rats: A – a histological picture of the retina of intact rats. B − marked degenerative changes compared to the intact retina of animals 72 hours after ischemia-reperfusion. The dilatation and uneven blood filling of the veins at the level of the choroid (arrow) in the control group of animals. The structural changes of the retina in the form of edematous changes and maceration of the inner nuclear layer (double arrow). OCD. with hematoxylin and eosin. Microphoto X400.

Результаты морфометрии представлены в таблице 2. Толщина внутреннего ядерного слоя сетчатки интактных крыс составила 23,8±1,0 мкм. Данный показатель после моделирования ишемии-реперфузии в группе контроля составил после 72 ч. реперфузии 20,3±0,8 мкм, что достоверно отличается от значений в группе интактных животных (р<0,05) и свидетельствует о развитии дегенеративных изменений на данном сроке. На фоне коррекции патологии ДИП толщина внутреннего ядерного слоя увеличивается до 21,7±0,4 мкм (р<0,05) по сравнению с группой контроля. При коррекции никорандилом данный показатель возрастает до 22,9±0,5 мкм (р<0,05) по сравнению с группой контроля и соотносим со значениями в группе интактных крыс. Введение глибенкламида в группах с коррекцией предотвращало увеличение толщины внутреннего ядерного слоя за счет устранения эффекта прекондиционирования Результаты морфометрии слоя фоторецепторов во всех экспериментальных группах не выявили статистически значимых отличий, что подтверждает сохранение функциональной активности фоторецепторов в отличие от выраженной дисфункции клеток внутреннего ядерного слоя сетчатки из-за ухудшения трофики нейронов при нарушениях ретинальной циркуляции в результате формирования ишемии (таб.2).

Таблица 2

Морфометрические изменения в сетчатке через 72 часа реперфузии (M±m; n=10)

Table 2

Morphometric changes in the retina after 72 hours of reperfusion

 (M±m; n=10)

Примечание: * - р<0,05 в сравнении с группой интактных животных;  у - р<0,05 в сравнении с группой контроля