Введение. В настоящее время пристальное внимание уделяется научным исследованиям, отражающим влияние различных стрессовых факторов на организм человека [1, 2]. Установлено, что длительное стрессовое воздействие приводит к формированию неврологических, иммунных, эндокринных, метаболических и других видов расстройств, а также развитию нарушений молекулярно-клеточных механизмов апоптоза, в том числе нейроцитов [3, 4]. В связи с чем в настоящее время пристальное внимание уделяется оценке роли апоптотических и нейротрофических факторов в реализации стрессовой реакции.

Наиболее информативными показателями в оценке апоптотических процессов являются фактор некроза опухоли, инициаторные и эффекторные каспазы [5, 6]. Результаты многочисленных исследований показали, что фактор некроза опухоли способствует увеличению секреции воспалительных медиаторов, что относит данный цитокин к одному из самых значимых активаторов апоптоза [7, 8]. Установлено, что уровень TNF-α повышен у пациентов с психоневрологическими и нейродегенеративными заболеваниями, а также травматическими повреждениями головного мозга. Установлено, что в результате воздействия стрессогенных факторов наблюдается формирование комплекса TNF-α с рецепторами Fas с последующей активацией сигнальных молекул, который активирует инициирующую каспазу-8 и эффекторную каспазу-3, в результате чего развивается необратимое повреждению нейронов [9, 10, 11]. Установленный процесс инициации характерен также для развития апоптоза в лимфоидных и эндотелиальных клетках, что, в свою очередь, способствует развитию иммунной дисфункции, а также патологии различных систем организма [12, 13, 14].

При рассмотрении нейротрофиновой гипотезы развития различных патологических нарушений, в том числе апоптоза, таким нейротрофическим факторам, как фактор роста нервов и нейротрофический фактор мозга, обладающим выраженной нейроспецифичностью, отводится важное значение в проявлении нейропротекторного действия за счет реализации их способности к индукции синтеза антиапоптотических белков и ингибированию проапоптотических, оказывая влияние тем самым на выживаемость и дифференцировку отдельных популяций нейронов [15, 16]. Доказано, что апоптоз напрямую зависит от баланса NGF и BDNF, которые активируя рецепторы тирозинкиназ, оказывают нейропротекторное действие. Установлено, что фактор роста нервов привлекает внимание ученых в качестве перспективного средства лечения различных психоневрологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и депрессия [17, 18]. Доказана способность фактора роста нервов к индукции высвобождения иммуноактивных нейропептидов и нейротрансмиттеров, а также к влиянию на врожденные и адаптивные иммунные реакции. Доказано также, что уровень сывороточного BDNF имеет отрицательную корреляционную связь со степенью выраженности тревожных расстройств и даже в ряде случаев определяет развитие нейродегенеративных процессов [19, 20].

Таким образом, апоптотические и нейротрофические факторы играют важную роль в реализации адаптационных механизмов к стрессовым воздействиям различного генеза и определяет перспективность рассмотрения его в качестве мишени для стресспротекторов.

В настоящее время особый интерес вызывают нейропептидные соединения, на основе которых синтезируется большое количество высокоэффективных и безопасных лекарственных препаратов, обладающих разносторонней фармакологической активностью, в том числе и стресспротекторной [21]. На сегодняшний день в ряду пептидных соединений в отдельную группу выделены регуляторные пептиды - меланокортины [22, 23], представителем которых является зарегистрированный препарат Семакс, синтезированный учеными Института молекулярной генетики Национального исследовательского центра «Курчатовский институт». В медицинской практике Семакс применяется с целью улучшения мнестических функций. Доказано, что наряду с нейротропной активностью, данный препарат оказывает иммунотропное, антиоксиданьное, противогипоксическое и др. виды действия [24]. Описанные свойства актуализируют необходимость детального изучения фармакологического действия нейропептидов семейства меланокортинов.

Цель исследования. Изучить влияние меланокортиновых нейропептидных соединений на уровень апоптотических (каспаза-3, каспаза-8, TNF-α) и нейротрофических (BDNF, NGF) факторов в сыворотке крови белых крыс в условиях «социального» стресса.

Материал и методы исследования. Исследование проводили на 70 белых крысах-самцах 6-месячного возраста. Содержание лабораторных животных отвечало требованиям международной нормативной документации [25] и протоколу Этического комитета ФГБОУ ВО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России № 8 от 24 ноября 2015 г.

«Социальный» стресс моделировали путем обеспечения условий проживании крыс при наличии сенсорного контакта и отсутствии физического с последующим формированием агрессивного и субмиссивного типа поведения [26, 27, 28] при размещении животных попарно в клетках, разделенных прозрачной перегородкой. С целью наблюдения за межсамцовыми конфронтациями ежедневно на 10 мин снимали перегородку, по результатам чего были сформированы группы крыс «агрессоров» и «жертв». Агрессивность крыс оценивалась по наличию вертикальных и боковых стоек и атаки, а субмиссивность – по наличию неподвижности, обнюхивания, аутогруминга, вертикальных «защитных» стоек.

В исследовании формировались экспериментальные группы (n = 10): контрольные животные; животные, в течение 20 дней подвергавшиеся воздействию стресса; группы крыс, получавших внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг/сут, начиная с 1-го дня воздействия стресс-фактора, курсом 20 дней меланокортиновые соединения АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (Семакс) и АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro

Выбор дозы нейропептидных соединений основан на предварительном изучении выраженности психомодулирующего эффекта. Исследования проводили при введении исследуемых соединений в дозах 25, 50, 100 и 200 мкг/кг/сут. Было установлено, что наиболее активными дозами явились 100 и 200 мкг/кг/сут. В связи с чем, в качестве экспериментальной дозы в дальнейшем была выбрана наименьшая – 100 мкг/кг/сут.

Влияние нейропептидов на уровень каспазы-3, каспазы-8, TNF-α, BDNF, NGF в сыворотке крови белых крыс оценивали методом иммуноферментного анализа с использованием иммунологического анализатора «Multiscan FC» и применением высокочувствительных наборов ELISA Kit for Caspase-8 (США); ELISA Kit for Caspase-3 (США); ELISA Kit for Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) (США), ELISA Kit for Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) (США); ELISA Kit for Nerve Growth Factor (NGF) (США).

Нейропептидные соединения для исследования предоставлены Институтом молекулярной генетики Национального исследовательского центра «Курчатовский институт».

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета Exсel и программного обеспечения BIOSTAT, с учетом критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми различия считали при p≤0,05.

Результаты и их обсуждение. Результаты, отражающие влияние меланокортинов на уровень каспаз-3 в сыворотке крови белых крыс в условиях «социального» стресса, представлены рисунке 1.

При формировании «социального» стресс у животных с агрессивным типом поведения уровень каспазы-3 увеличился практически на 76% (p≤0,01) по отношению к контролю. При введении меланокортиновых соединений было отмечено снижение уровня исследуемого показателя: при АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (Семакс) – на 30% (p≤0,01) и АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro – на 20% (p≤0,05) в сравнении с группой стресс.

В группе стрессированных животных с субмиссивным типом поведения уровень каспазы-3 увеличился на 60 % (p ≤ 0,01) по отношению к контрольной группе животных. При введении АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (Семакс) отмечалось снижение уровня показателя более чем на 15% (p≤0,05), АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro – на 12% (p≥0,05) по сравнению с группой «социального» стресса.

Результаты, отражающие влияние меланокортинов на уровень каспаз-8 в сыворотке крови белых крыс в условиях «социального» стресса, представлены рисунке 2.

Формирование «социального» стресса привело к увеличению уровня каспазы-8 в 2,6 раза (p≤0,01) в сравнении с контрольными крысами. Введение меланокортиновых соединений АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (Семакс) и АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro способствовало снижению данного показателя в 1,5 раза (p≤0,01), в 1,2 (p≤0,01) соответственно по отношению к группе стрессированных животных.

Уровень каспазы-8 в группе стрессированных животных с субмиссивным типом поведения увеличился в 2,4 раза (p≤0,01) по отношению к интактным животным. Введение меланокортиновых нейропептидных соединений АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (Семакс) и АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro способствовало снижению уровня изучаемого показателя на 24% (p≤0,05); на 19% (p≤0,01) соответственно по сравнению с группой «социального» стресса.

На рисунке 3 представлены результаты, отражающие влияние нейропептидов меланокортиновой структуры на уровень TNF-α в сыворотке крови белых крыс в условиях «социального» стресса.

Формирование «социального» стресса у животных с агрессивным типом поведения привело к увеличению уровня фактора некроза опухоли на 45% (p≤0,01) в сравнении с контрольной группой животных. На фоне введения меланокортиновых нейропептидов АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (Семакс) и АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro было отмечено снижение данного показателя на 27% (p≤0,01) и 23% (p≤0,01) соответственно по отношению к стрессированным животным.

В группе крыс с субмиссивным типом поведения при формировании стресса уровень TNF-α увеличился на 52% (p≤0,01) в сравнении с контролем. Соединения АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (Семакс) и АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro вызвали снижение данного показателя на 33% (p≤0,01) и 24% (p≤0,01) по отношению к группе «социального» стресса.

На рисунке 4 показаны результаты, отражающие влияние меланокортинов на уровень NGF в сыворотке крови белых крыс в условиях «социального» стресса.

В группе животных с «социальным» стрессом и агрессивным типом поведения наблюдалось снижение уровня NGF на 28% (p≤0,01) в сравнении с интактными животными. При введении меланокортинов АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (Семакс) и АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro было отмечено повышение уровня исследуемого фактора на 28% (p≤0,01) и 27% (p≤0,01) соответственно в сравнении с группой «социального» стресса.

Формирование «социального» стресса в группе животных с субмиссивным типом поведения привело к снижению уровня NGF на 36% (p≤0,01) в сравнении с контрольной группой. На фоне введения меланокортинов АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (Семакс) и АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro было отмечено повышение уровня фактора роста нервов на 55% (p≤0,01) и 44% (p≤0,01) соответственно по сравнению с группой «социальный» стресс.

На рисунке 5 представлены результаты, отражающие влияние меланокортинов на уровень нейротрофического фактора BDNF в сыворотке крови белых крыс в условиях «социального» стресса.

В группе стрессированных животных с агрессивным типом поведения было отмечено снижение уровня нейротрофического фактора головного мозга на 40% (p≤0,01) в сравнении с контрольной группой. Введение соединений АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (Семакс) и АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro способствовали увеличению уровня мозгового нейротрофического фактора по отношению к стрессированной группе животных на 60% (p≤0,01) и 38% (p≤0,01) соответственно.

В группе стрессированных крыс с субмиссивным типом поведения было отмечено снижение уровня BDNF на 45% (p≤0,01) в сравнении с контрольными животными. При введении меланокортиновых соединений также отмечались изменения уровня исследуемого нейротрофического фактора в виде его статистически значимого повышения (p≤0,01): на фоне АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (Семакс) – на 78% и АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro – 55% по отношению к группе животных, подверженных воздействию «социального» стресса.

В результате проведения данного исследования было установлено, что «социальный» стресс сопровождается снижением уровня BDNF и NGF, что связано с изменением нейропластичности с последующим угнетением нейрогенеза. В ряде экспериментальных работ доказано, что BDNF обладает выраженными нейропротекторными свойствами, способствуя угнетению клеточного апоптоза, препятствуя, в свою очередь, гибели нейронов и стимулируя рост холинергических нервных волокон [20]. В эксперименте установлено, что в условиях «социального» стресса наряду со снижение уровней нейротрофических факторов наблюдается повышение уровней каспазы-3 и каспазы-8, а также TNF-α сыворотки крови белых крыс, что свидетельствует об усиление апоптотических процессов [13, 14]. Существенная роль нейротрофических факторов в индукции или торможении апоптоза доказана и в других экспериментальных работах. Установлено, что NGF тормозит апоптоз при ряде нейродегенеративных заболеваниях [20]. Кроме того, доказано, что фактор роста нервов и нейротрофический фактор головного мозга реализуют свое действие через генетические механизмы индукции апоптотических процессов [22].

Снижение экспрессии нейротрофических факторов в результате стрессогенных воздействий различной природы и восстановление его уровня продолжительным введением средств коррекции привели к созданию нейротрофической гипотезы развития стресс-индуцированной депрессии, согласно которой изменение уровня нейротрофических факторов является ключевым механизмом формирования и разработки подходов к лечению подобных нарушений [17]. Установленная в данном исследовании корригирующая активность меланокортиновых нейропептидов в отношении уровня нейротрофических факторов при «социальном» стрессе свидетельствует о проявлении АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (Семакс) и АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro выраженных антистрессорных и нейропротекторных эффектов, что сопровождается восстановлением уровней фактора роста нервов и нейротрофического фактора головного мозга [28].

Наряду с этим, установлено, что введение нейропептидных соединений АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (Семакс) и АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro на фоне «социального» стресса способствует снижению уровня апоптотических показателей – капсазы-3, каспазы-8 и фактора некроза опухоли, что опосредовано, возможным, ингибированием каспаза-зависимого каскада реакций разрушения клеточных структур путем, гидролиза ядерной ламины, расщепления адгезивных белков и разрушения цитоскелета [29, 30]. Данный путь, наряду с каспазами, реализуется с участием рецепторов клеточной гибели, к которым относятся фактор некроза опухолей. Установлено, что нейропептидные соединения в условиях «социального» стресса вызывают выраженное ингибирование процессов свободнорадикального окисления и снижают концентрацию провоспалительных цитокинов таких как IL–1β, IL–6 и TNF-α [22, 23]. На основании полученных результатов можно сделать вывод о наличие у меланокортинов антиапоптотического действия за счет влияния на уровень каспаз, концентрацию провоспалительных цитокинов и ингибирование процессов перекисного окисления липидов [23].

Заключение. Таким образом, проведенное исследование позволило установить наличие у меланокортиновых нейропептидов АКТГ(4-7)-Pro-Gly-Pro (Семакс) и АКТГ(6-9)-Pro-Gly-Pro антиапоптотической активности за счет ингибирования каспаза-зависимого каскада реакций апоптоза, а также выраженного стресс-протекторного действия за счет восстановления уровня нейротрофических факторов мозга, что актуализирует дальнейшее детальное изучение каспаза-зависимого и опосредованного нейротрофическими факторами механизма антистрессорного эффекта меланокортинов.

Информация о финансировании

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, грант РФФИ № 19-04-00461.