Введение. В организме человека микробиота выступает особым «экстракорпоральным микробным органом», прямо или косвенно участвующим практически во всех физиологических функциях [1, 2, 3]. При воздействии на макроогранизм различных экзогенных ксенобиотиков происходят качественные и/или количественные изменения состава микробиоценоза – состояние, называемое дисбиозом [4, 5]. В результате такого действия также усиливается перекисное окисление липидов (ПОЛ) и развивается адаптационный стресс неспецифического характера, что приводит к нарушению работы системы антиоксидантной защиты (АОЗ) как характерной реакции организма на различного рода воздействия [6, 7].

В современном мире большой интерес вызывают ксенобиотики-поллютанты, в частности фунгицидные препараты, одним из которых является тетраметилтиурамдисульфид (тирам, ТМТД). Данный препарат высокотоксичен, обладает способностью сохраняться в продуктах первичной переработки сельскохозяйственных культур, поэтому является опасным для организма человека и животных. Тирам экологически опасен, невзирая на его высокую экономическую эффективность применения. Фунгицидные препараты на основе тирама нашли свое применение в борьбе с такими заболеваниями растений, как антракоз и аскохитоз, а также используются для исключения плесневения семян [8, 9]. Согласно классификации опасности фунгицидов, препараты на основе тирама относятся к 3 классу опасности для человека [10]. При попадании в организм с продуктами переработки агрокультур могут оказывать влияние на желудочно-кишечный тракт, особенно на микрофлору толстой кишки [11].

Для коррекции изменений прооксидантно-антиоксидантного статуса макроорганизма, вызванных воздействием ксенобиотиков, целесообразно использовать антиоксидантные препараты [12], среди которых можно выделить широко используемый витамин E и растительный антиоксидант облепиховое масло. Витамин E применяется как антиоксидант, который препятствует образованию свободных радикалов, то есть является защитником клеточных мембран от перекисного окисления. В настоящее время установлено, что витамин E играет важную роль в функционировании нервной ткани, обладает способностью предупреждать развитие апоптоза клеток в условиях окислительного стресса, обладает иммуномодулирующим, антипролиферативным, антиангиогенным действием [13]. Облепиховое масло является ценным источником водо- и жирорастворимых витаминов, а также микроэлементов, флавоноидов и каротиноидов [14].

Цель исследования. Изучение состояния микробиоты толстой кишки и антиоксидантных свойств колоноцитов крыс при субхронической интоксикации тирамом и коррекции витамином E и облепиховым маслом.

Материалы и методы исследования. В эксперимент были взяты 150 крыс популяции Вистар массой 200-220 грамм. Для выполнения эксперимента животных разделили на 5 групп по 30 особей в каждой. Первая группа являлась контрольной, в нее входили здоровые интактные крысы (группа «контроль (интактные)»), забой производили через 28 суток. Животным второй группы моделировали субхроническую интоксикацию (группа «тирам 28 суток»), забой производили через 28 суток. Крысы получали пестицид тирам (Cas Number: 137-26-8) чистотой 97% (Sigma-Aldrich, USA) вместе с гранулированным кормом 1 раз в день утром в дозе 1/50 LD50 (1,6 мг) на протяжении четырех недель [15, 16]. При этом кормовые гранулы измельчали, после чего добавляли навеску пестицида, перемешивали, добавляли 2 мл дистиллированной воды и сушили образовавшиеся гранулы на воздухе в течение 12 часов. Третью группу составили животные, получавшие пестицид тирам с кормом 1 раз в сутки в течение 28 дней, после чего их переводили на стандартный пищевой рацион на 30 дней (группа «контроль (стандартный рацион)»), забой производили через 58 суток. У животных четвертой группы моделировали субхроническую интоксикацию на протяжении 28 суток, с последующим применением per os антиоксиданта витамина E (Альфа-Токоферола Ацетат, ЭКОлаб ЗАО (Россия)) в дозе 8,58 мг/кг в течение 30 дней (группа «витамин E»), забой производили через 58 суток. У животных пятой группы моделировали субхроническую интоксикацию на протяжении 28 суток, с последующим применением per os антиоксиданта облепихового масла (Облепихи масло, Вифитех ЗАО (Россия)) в дозе 0,78 мг/кг в течение 30 дней (группа «облепиховое масло»), забой производили через 58 суток.

Расчет доз проводили следующим образом. Витамин E. В перерасчете на 1 кг веса человека необходимо 1,43 мг/кг препарата. Коэффициент пересчета дозы с отдельного животного на человека составляет 39,0. Для крысы массой 200 грамм коэффициент пересчета составляет 6,5. Следовательно, терапевтическая доза витамина Е для крыс составляет: (1,43* 39) /6,5 = 8,58 мг/кг. Облепиховое масло. В пересчете на 1 кг веса человека данного препарата необходимо 0,13 мг/кг. Коэффициент пересчета дозы с отдельного животного на человека составляет 39,0. Для крысы массой 200 грамм коэффициент пересчета составляет 6,5. Поэтому терапевтическая доза облепихового масла для крыс составляет: (0,13*39) /6,5 = 0,78 мг/кг [16].

Экспериментальное исследование проводили, соблюдая требования, изложенные в Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей. Протокол заседания регионального этического комитета № 4 от 30 ноября 2017 г. Забой животных осуществляли декапитацией под эфирным наркозом.

После окончания эксперимента у животных всех опытных групп оценивали микроэкологическое состояние муцинового слоя толстой кишки, состояние ПОЛ и АОЗ в колоноцитах животных.

Исследование микрофлоры слизистой оболочки толстой кишки животных проводили по методике Л.И. Кафарской и В.М. Коршунова и выражали в lg КОЕ/г массы биологического материала [17]. Для подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) применяли следующую формулу:

Посев производили на чашки Петри из максимального разведения, где наблюдался рост не менее 10 колоний микроорганизмов [18, 19, 20]. Используя масс-спектрометр Maldi Biotyper Microflex (Bruker) идентифицировали микроорганизмы.

Антиоксидантные свойства колоноцитов оценивали по стандартной методике путем гомогенизации 100 мг участка толстой кишки в 1 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера (рН 7,4), предварительно охлажденного до 0°С, в соотношении ткань-буфер 1:6.

Активность ферментов системы АОЗ изучали по содержанию супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ) биохимическим методом в микропланшетном формате с помощью анализатора Clima RAC (Испания).

Для определения активности КАТ использовался диапазон измерения от 2 до 35 нмоль/мин/мл. Чувствительность – 2 нмоль/мин/мл. Длина волны измерения 540 нм. Анализ основан на реакции фермента с метанолом в присутствии Н₂О₂. Образующийся в реакции формальдегид детектируется колориметрически при взаимодействии с хромогеном 4-амино-3-гидразин-5-меркапто-1,2,4-триазол (Пурпальд), при котором происходит изменение бесцветной окраски на фиолетовую.

Активность СОД определяли биохимическим методом с использованием тетразолиевой соли для выявления супероксидных радикалов, образованных ксантин оксидазой и гипоксантином при длине волны измерения 440-460 нм.

Состояние ПОЛ оценивали по содержанию диеновых коньюгатов (ДК) и малонового диальдегида (МДА).

Содержание ДК определяли спектрофотометрическим методом. К исследуемым образцам объемом 0,5 мл, разведенным 5мМ ТРИС-HCl буфером с рН 7,6 в соотношении 1:19, добавляли экстрагирующую смесь гептана с изопропиловым спиртом (1:1 по объему) в количестве 4,5 мл. Далее активным встряхиванием в течение 5 минут пробы тщательно перемешивали, после чего отстаивали до образования четкой границы между фазами. Затем отбирали гептановую (верхнюю) фазу в количестве 0,5 мл и добавляли к ней 96⁰ этиловый спирт в количестве 2,5 мл. В кювете с длиной оптического пути 10 мм определяли оптическую плотность раствора против этилового спирта с гептаном (соотношение 5:1) при длине волны 233 нм с помощью биохимического анализатора Clima RAC (Испания). С учетом разведения с использованием молярного коэффициента светопоглощения на указанной длине волны (e=2,2×10⁵ М^-1×см^-1) производили расчет концентрации диеновых конъюгатов.

Для определения концентрации МДА использовался метод конкурентного ингибирования с применением иммуноферментного анализа при длине волны 450 нм. Моноклональные антитела, специфичные к МДА, были предварительно нанесены на микропланшет. Реакция конкурентного ингибирования запускается между меченым биотином МДА и немеченым МДА с предварительно нанесенными антителами, специфичными к МДА. После инкубации несвязанный конъюгат смывали. Далее авидин, конъюгированный пероксидазой хрена (HRP), добавляли в каждую лунку микропланшета и инкубировали с помощью микропланшетного ридера Varioscan Flash (Thermo Fisher Scientific, USA). Количество связавшегося конъюгата HRP обратно пропорционально концентрации МДА в образце. Интенсивность окрашивания обратно пропорциональна концентрации МДА в образце.

Показатели активности системы АОЗ и состояния ПОЛ исследовали с помощью следующих коммерческих наборов: Catalase Assay Kit, 707002, 96 тестов (Cayman Chemical, USA); Superoxide Dismutases Assay Kit, 706002, 96 тестов (Cayman Chemical, USA); CEA597Ge ELISA Kit for Malondialdehyde (MDA) (Cloud-Clone Corp., USA) и CEA634Ge ELISA Kit for Diene Conjugates (Cloud-Clone Corp., USA).

Результаты эксперимента статистически обрабатывали в программе «STATISTICA 13.0» (Stat Soft, USA). Проводилась проверка на нормальность распределения признака, с использованием критерия Колмагорова-Смирнова. Если полученные p для данного статистического теста были выше критического (p=0,05), то распределение считали, подчиняющемся закону нормального распределения. Из этого следовало, что для дальнейшего статистического анализа использовались параметрические методы обсчета данных. При описании количественных признаков использовались параметры нормального распределения: среднее значение (M), стандартная ошибка среднего значения (±m), стандартное отклонение (σ), дисперсия (σ²). Для проверки статистических гипотез использовали критерий Стьюдента (t). Пороговый уровень статистической значимости принимали равный 0,05.

Результаты и их обсуждение. Согласно современным данным, тирам относится к группе ксенобиотиков, нарушающих многоуровневые системы гомеостаза. Одним из ключевых аспектов негативного влияния тирама на макроорганизм является его общетоксическое действие, способность концентрироваться и передаваться по трофическим цепям, что может играть роль в развитии патологических состояний как напрямую, за счет кумулятивного эффекта, так и опосредованно, вследствие влияния на состояние желудочно-кишечного тракта [10]. Поэтому первым этапом работы было изучение влияния введения тирама в течение 28 суток на микроэкологическое состояние толстой кишки крыс (Табл. 1).

Достоверное снижение значений определяемого показателя было зафиксировано в отношении облигатных симбионтов толстой кишки: бифидобактерий в 3 раза (p<0,001) с lg 8,95±1,29 до lg 3,00±0,27, лактобацилл в 2,5 раза (p<0,001) с lg 6,32±0,66 до lg 2,50±0,25, кишечной палочки с нормальной ферментативной активностью в 2,2 раза (p<0,001) с lg 4,75±0,60 до lg 2,18±0,18, эшерихий со сниженной ферментативной активностью в 2,8 раза (p<0,001) с lg 3,10±0,44 до lg 1,11±0,11.

На фоне введения тирама в течение 28 суток отмечалось снижение количества условно-патогенных энтеробактерий: энтеробактеров в 1,8 раза (p<0,001), сальмонелл в 1,7 раза (p<0,01) и цитробактеров в 1,75 раза (p<0,01).

Содержание факультативных грамположительных бактерий характеризовалось уменьшением значений определяемого показателя для коагулазонегативных стафилококков до lg 1,10±0,13 против lg 2,32±0,29 (в 2,1 раза (p<0,001)) и для энтерококков до lg 1,04±0,12 против lg 1,57±0,16 в контроле (в 1,5 раза (p<0,05)).

Бактерии рода Morganella и грибы рода Candida в микробиоценозе описываемой опытной группы не обнаружены.

Многочисленные исследования доказали важность и уникальность микробиома в жизнедеятельности человека. Микробиом кишечника выполняет тесновзаимосвязанные функции: защитную, метаболическую, иммунную, эпигенетическую и др., Кишечная микробиота играет важнейшую роль в становлении и поддержании иммунитета. Поэтому изменения качественного и количественного состава сообщества микроорганизмов толстой кишки могут привести к ряду воспалительных заболеваний кишечника, заболеваниям печени, ожирению, пищевой аллергии и др. [21, 22, 23].

Активные формы кислорода, образующиеся при воздействии на макроорганизм экзогенных факторов, инициируют процессы перекисного окисления липидов, которые играют важнейшую роль в функционировании клеток и тканей, а также развитии многих заболеваний [24]. Фактором, останавливающим развитие окислительного стресса, является система антиоксидантной защиты организма, главной функцией которой является поддержание баланса между анти- и прооксидантными системами [25].

Состояние антиоксидантной защиты в толстой кишке крыс оценивали, определяя активность каталазы и супероксиддисмутазы (Табл.2).

При введении тирама в течение 28 суток отмечалось снижение активности каталазы в 1,9 раза (p<0,001) относительно контрольной группы. Активность СОД достоверно сократилась с 12,85±1,28 в контроле до 5,48±0, 61, то есть в 2,3 раза (p<0,001). В ходе исследования зарегистрировано увеличение концентрации продуктов перекисного окисления липидов: МДА в 2,6 раза (p<0,001), а ДК – в 2,4 раза (p<0,001) (Табл. 2).

Активация процессов перекисного окисления липидов на фоне снижения концентрации ферментов антиоксидантной системы приводит к повреждению структурных компонентов клеточных мембран [26].

По мнению ряда авторов, состояние дисбиоза не нуждается в коррекции ввиду высоких адаптационных возможностей макроорганизма и его способности к саморегуляции [27]. В связи с вышесказанным, следующим этапом работы явилось изучение состояния микробиоценоза толстой кишки и биохимических показателей колоноцитов в отсутствии терапии, когда животные после интоксикации были переведены на стандартный пищевой режим.

Отсутствие коррекции изменений качественного и количественного состава микробиоты толстой кишки крыс, вызванных применением тирама в течение 28 суток (группа «контроль (стандартный рацион)»), способствовало заселению данного биотопа облигатными симбионтами (Табл. 3).

Содержание лактобактерий возросло в 1,7 раза (p<0,001) с lg 2,50±0,25 в группе «тирам 28 суток» до lg 4,27±0,45 в группе «контроль (стандартный рацион)», а бифидобактерий – в 2,1 раза (p<0,001) с lg 3,00±0,27 до lg 6,22±0,88. В отношении кишечной палочки также отмечено увеличение значения определяемого показателя, при этом удельное содержание эшерихий с нормальной ферментативной активностью в 1,6 раза (p<0,01) выше, чем в контроле, тогда как число кишечных палочек со сниженной ферментативной активностью превысило значения в контрольной группе в 3,7 раза (p<0,001).

Количество энтеробактеров и цитробактеров возросло в 2,3 и 2,4 раза (p<0,001) соответственно по отношению к группе «тирам 28 суток». Численность Salmonella spp. увеличилось в 2 раза (p<0,001) и составило lg 4,32±0,45 против lg 2,16±0,27 в контрольной группе. Родовое разнообразие грамотрицательных бактерий в составе микробиоценоза толстой кишки расширилось за счет отсутствовавших в группе «тирам 28 суток» клебсиелл (lg 2,98±0,30), морганелл (lg 3,18±0,37), ацинетобактера (lg 2,22±0,31) и протея (lg 2,73±0,34).

Численность грамположительных бактерий характеризовалась увеличением количества энтерококков в 2,3 раза (p<0,001) (с lg 1,04±0,12 в контроле до lg 2,73±0,28 в опытной группе) и коагулазоотрицательных стафилококков в 2,8 раза (p<0,001) (с lg 1,10±0,13 до lg 3,10±0,39).

Кроме того, в составе микробиоценоза толстой кишки животных опытной группы выявлены не зарегистрированные в контроле Staphylococcus aureus в количестве lg 2,56±0,36 и грибы рода Candida, lg КОЕ/г которых составил 3,05±0,38.

Таким образом, согласно полученным данным в исследуемой группе животных, находящихся на стандартном рационе, после интоксикации тирамом отмечено, что отсутствие коррекции, вызванных тирамом нарушений привело к усугублению состояния дисбиоза в виде увеличения колонизации толстой кишки условно-патогенными микроорганизмами.

Следует отметить, что у крыс при отсутствии коррекции нарушений показателей антиоксидантных свойств колоноцитов (группа «контроль (стандартный рацион)») не было зарегистрировано статистически достоверных изменений КАТ, СОД, МДА и ДК по отношению к группе «тирам 28 суток» (Табл. 4).

Коррекция витамином E привела к увеличению количества облигатных представителей микробиоценоза толстой кишки – лактобактерий в 1,4 раза (p<0,05) с lg 4,27±0,45 в группе «контроль (стандартный рацион)» до lg 5,94±0,50 в опытной группе (таблица 3). При применении витамина E отмечено уменьшение численности условно-патогенных микроорганизмов: энтеробактеров, морганелл и ацинетобактеров в 1,5 раза (p<0,05), 2 раза (p<0,001) и 1,8 раза (p<0,01) соответственно.

Значения определяемого показателя в отношении других представителей микробиоценоза исследуемого биотопа не достигли статистической значимости.

В группе животных, получавших витамин E, установлено достоверное снижение содержания МДА в 3 раза (p<0,001), ДК в 2,4 раза (p<0,001) и увеличение активности ферментов АОЗ: активность каталазы повысилась с 5,96±0,61 в контроле до 9,12±0,83 в опытной группе (в 1,5 раза (p<0,01)), а супероксиддисмутазы – с 7,06±0,71 до 11,22±0,98 (в 1,6 раза (p<0,001)).

Согласно полученным результатам исследования, основной функцией витамина E является защита клеток от свободных радикалов – антиоксидантная функция. Современные исследования также показывают, что витамин E играет важную роль в регуляции активности ферментов, сигнальных путей и физиологических процессов [28].

Коррекция облепиховым маслом привела к достоверному снижению удельного содержания ряда условно-патогенных бактерий (Табл. 3). Количество микроорганизмов, принадлежащих роду Enterobacter, уменьшилось в 1,6 раза (p<0,01) с lg 2,85±0,30 в группе «контроль (стандартный рацион)» до lg 1,83±0,18 в опытной группе. Число морганелл было в 2,3 раза (p<0,001) ниже контрольных значений и составило lg 1,38±0,14. Отмечено снижение содержания бактерий рода Acinetobacter в 2 раза (p<0,001) по сравнению с контролем (с lg 2,22±0,31 до lg 1,13±0,12).

При применении облепихового масла выявлено увеличение количества лактобактерий, бифидобактерий, эшерихий с нормальной и со сниженной ферментативной активностью, однако различия между значениями определяемых показателей в контрольной и опытной группах не достигли уровня статистической значимости.

Высокое содержание каротина, каротиноидов и токоферола в составе облепихового масла обеспечивает его выраженные антиоксидантные свойства. В качестве источников флавоноидов облепиховое масло играет роль в нейтрализации перекисных процессов на инициирующей стадии [29].

Коррекция облепиховым маслом вызванных введением тирама нарушений привела к интенсификации процессов антиоксидантной защиты в ткани толстой кишки, что проявлялось в увеличении концентрации каталазы в 1,4 раза (p<0,05) (с 5,96±0,61 в группе «контроль (стандартный рацион)» до 8,44±0,85 в опытной группе) и супероксиддисмутазы в 1,6 раза (p<0,001) (с 7,06±0,71 до 11,54±1,13) (Табл. 4). Снижение процессов ПОЛ в ткани толстой кишки на фоне применения антиоксиданта облепихового масла сопровождалось уменьшением концентрации МДА до 0,71±0,08 против 2,04±0,21 в контроле, то есть в 2,9 раза (p<0,001). Содержание ДК оказалось ниже контрольных значений в 1,9 раза (p<0,001), что составило 0,31±0,04 против 0,60±0,06 в группе «контроль (стандартный рацион)».

Результаты, полученные в ходе исследования, подтверждают наличие у облепихового масла выраженных антиоксидантных свойств.

Анализируя полученные в эксперименте данные, следует отметить, что при применении облепихового масла зарегистрировано достоверное изменение 3 из 15 (энтеробактеры, морганеллы, ацинетобактеры) представителей толстокишечного микробиоценоза, в то время как использование витамина E привело к восстановлению 4 представителей из 15 исследуемых (лактобактерии, энтеробактеры, морганеллы, ацинетобактеры). При изучении состояния антиоксидантной защиты и процессов перекисного окисления липидов также отмечено более выраженное действие витамина E в отношении восстановления исследуемых показателей КАТ, СОД, МДА и ДК.

Заключение. Результаты, полученные в ходе проведенного эксперимента, показывают влияние тирама на состояние динамического равновесия микробиоценоза толстой кишки и биохимические показатели колоноцитов. А именно, субхроническая интоксикация тирамом привела к уменьшению количества облигатных представителей толстокишечного микробиоценоза (бифидобактерий, лактобактобактерий, кишечной палочки) на фоне повышенного содержания условно-патогенных микроорганизмов. В том числе, накапливающиеся в условиях дисбиоза токсины и продукты метаболизма условно-патогенных бактерий способны запускать развитие адаптационного синдрома, о чем свидетельствует увеличение продуктов перекисного окисления липидов (диеновых коньюгатов и малонового диальдегида). В то же время повышается количество активных форм кислорода, которые обладают повреждающим действием [7], в результате чего наблюдается снижение активности каталазы и супероксиддисмутазы – декомпенсация антиоксидантной защиты макроорганизма.

Применение антиоксиданта витамина E способствовало увеличению количества лактобактерий, а также уменьшению условно-патогенных представителей микробиома исследуемого биотопа. Использование антиоксиданта облепихового масла привело к снижению численности условно-патогенных бактерий в составе микробиоценоза толстой кишки и не оказывало ингибирующего влияния на состав облигатных симбионтов данного биотопа.

Использование витамина E и облепихового масла в эксперименте способствовало активации ферментов антиоксидантной защиты в условиях снижения концентрации продуктов ПОЛ в колоноцитах.

Таким образом, высокая биологическая активность витамина E и облепихового масла обеспечивает широкое применение данных антиоксидантов в качестве лекарственных средств и БАДов и имеет большие перспективы.

Информация о финансировании

Работа выполнена за счет средств Курского государственного медицинского университета.