Списоксокращений

NO – оксид азота;

ЧСС (HR), уд. /мин – частота сердечных сокращений;

MxDMn, мс – разность между максимальным и минимальным значениями кардиоинтервалов, или вариационный размах;

SDNN, мс – стандартное отклонение полного массива кардиоинтервалов;

CV, % – коэффициент вариации полного массива кардиоинтервалов;

RMSSD, мс – квадратный корень из суммы разностей последовательного ряда кардиоинтервалов;

pNN50, мс – число пар кардиоинтервалов с разницей более 50 мс в % у общему числу кардиоинтервалов;

Mo, мс – мода;

AMo, мс – амплитуда моды;

SI, усл.ед. – стресс-индекс (индекс напряжения регуляторных систем);

TP, мс² – суммарная мощность спектра временных значений R-R интервалов сердечного ритма (без ультранизкочастотных составляющих, определяемая как сумма сложения HF, мс², LF мс², VLF мс²);

HF – мощность спектра высокочастотного компонента вариабельности сердечного ритма в диапазоне 0,4-0,15 гц (дыхательные волны);

LF мс² – мощность спектра низкочастотного компонента вариабельности сердечного ритма в диапазоне 0,15-0,04 гц (сосудистые волны);

VLF мс² – мощность спектра очень низкочастотного компонента вариабельности ритма сердца в диапазоне 0,04 - 0,015 гц.;

IC, усл. ед. – индекс централизации.

Введение. Вегетативная нервная система влияет на частоту сердечных сокращений и вариабельность сердечного ритма, параметры, которые измеряют изменения от удара к удару во временных интервалах между последовательными ударами сердца. Параметры вариабельности сердечного ритма часто анализируются для оценки баланса симпатической и парасимпатической регуляторных систем работы сердца [1]. Изменение частоты сердечных сокращений генерируется взаимодействием сердца и мозга через симпатическую и парасимпатическую ветви вегетативной нервной системы. Вариабельность кардиоинтервалов отражает реакцию вегетативных нервов сердца на сигналы от баро-, химио-, носоглоточных и других рецепторов, а также центральных вегетативных команд, которые связаны со стрессом, физической активностью, возбуждением, сном и т. д. [2, 3].

Вариабельность сердечного ритма является показателем регуляции вегетативного баланса, артериального давления, газообмена, сердца и сосудистого тонуса, помогая адаптироваться к различным психоэмоциональным и экологическим стрессорам среды. Показано, что вариабельность сердечного ритма как демонстрация функций автономной нервной системы отражает здоровье человека и его благополучие [4]. Основной функцией автономной нервной системы является гомеостаз. Активность вегетативной нервной системы и факторы риска тесно связаны между собой, поскольку дисбаланс вегетативной нервной системы способствует созданию предпатологической среды для факторов риска, таких как гипертония, диабет или фибрилляция предсердий, а также изменения эндотелиального гомеостаза в пользу протромботического/провоспалительного состояния, что в конечном итоге приводит к увеличению риска сердечно-сосудистых заболеваний [5, 6]. Таким образом, мониторинг характеристик вариабельности сердечного ритма имеет важное значение для профилактики развития сердечно-сосудистых заболеваний, фокусируясь на дисбалансе, характеризующимся снижением парасимпатической активности и одновременным увеличением симпатической активности [7]. Указывается и на то, что показатели вариабельности сердечного ритма могут представлять собой маркер вертикальной интеграции, в том числе процессов адаптации, которые формируют активность ствола мозга и вегетативные реакции в организме. Поэтому неудивительно, что вариабельность сердечного ритма считается показателем стресса [8], а также отражает риски заболеваний и ускоренного старения [9].

Эндотелиальная NO-синтаза (NOS3) является основным источником сосудистого оксида азота, при этом известно, что большая часть вариабельности уровней оксида азота обусловлена генетически [10]. NOS3 является наиболее важной изоформой NO-синтазы в эндотелии сосудов, которая активирует продукцию оксида азота эндотелием сосудов, и, следовательно, играет ключевую роль в регуляции работы сердечно-сосудистой системы [11]. Ген эндотелиальной синтазы оксида азота (NOS3) клонирован в 1993 году и картирован на 7 хромосоме, а именно в позиции 7q35-36 [12]. Литературные данные свидетельствуют о том, что ген NOS3 является высокополиморфным – на данный момент описано не менее 11 полиморфизмов [13]. Полиморфизм -786T>C (rs2070744) представляет собой однонуклеотидный полиморфизм, который приводит к замене тимина (Т) на цитозин (С) в позиции 786 в промоторной области гена NOS3. Следствием данной замены является подавление транскрипции и значительное снижение экспрессии фермента, что в конечном счете, ведет и к уменьшению продукции окиси азота [14]. Согласно литературным данным, носители хотя бы одного аллеля NOS3*С (rs2070744), имеют меньшее количество мРНК и сниженный уровень оксида азота в крови по сравнению с носителями предкового аллеля NOS3*Т (rs2070744) [15]. В литературе имеются данные многих исследований, обнаруживших что функционирование некоторых параметров сердечно-сосудистой системы находится под влиянием в том числе и полиморфизма -786T>C (rs2070744) гена NOS3 [16, 17].

Исследования направленные на изучение роли оксида азота в регуляции активности вегетативной нервной системы начали проводить около 30 лет назад. Первоначальное предположение о том, что оксид азота может быть важным медиатором в вегетативном контроле сердца, возникло в результате демонстрации отдельных популяций нейронов, которые обладают NO-синтазой в пределах известных сердечных вегетативных путей [18]. Данные, полученные на животных, свидетельствуют о том, что оксид азота, синтезируемый в этих участках, активен в модуляции активности в обеих ветвях вегетативной нервной системы. При этом окись азота, по-видимому, действует как симпатолитическое средство, снижая активность в симпатовозбуждающих ядрах ствола головного мозга и уменьшая центральный симпатический отток, а также ослабляя сердечные реакции на симпатическую стимуляцию [18, 19]. И наоборот, оксид азота увеличивает активность в центральных блуждающих мотонейронах [20] и усиливает сердечный ответ на стимуляцию блуждающего нерва [21]. Однако до настоящего времени нет однозначного ответа, в полной мере объясняющего влияние NO на вегетативный контроль сердца человека.

Цель исследования. В соответствии с вышесказанным, для того чтобы получить более четкое представление о взаимосвязи между полиморфизмами гена NOS3 и вегетативной регуляцией, мы изучили особенности показателей вариабельности сердечного ритма в группе жителей-северян с разными вариантами генотипов по данному локусу.

Материалы и методы исследования. Для реализации поставленной цели проведено сплошное поперечное исследование жителей-северян Магаданской области в 2022 году. В рамках исследования была обследована выборка из 127 добровольцев-мужчин, преимущественно европейцев. Выборка сформирована из взрослого населения, основные характеристики исследуемой когорты жителей-северян представлены в таблице 1.

Критериями включения в группу исследуемых являлись: условно здоровые, относящиеся к 1-2 группам здоровья, неродственные мужчины, проживающие или рожденные на территории Магаданской области. Критериями исключения из обследований являлось наличие подтвержденных хронических или инфекционных заболеваний, наличие жалоб на состояние здоровья в период исследования, отсутствие информированного согласия на участие в исследовании. Исследование проводили в соответствии с протоколом, одобренным Локальным этическим комитетом ФГБУН НИЦ «Арктика» ДВО РАН (заключение от 26.11.2021г.) и Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы научных медицинских исследований с участием человека» (с поправками 2013 г.). При обнародовании результатов исследования все данные были деперсонизированы.

Программа комплексного обследования добровольцев включала: заполнение информированного согласия на участие в исследовании, проведение анкетирования с целью оценки состояния здоровья и выявления факторов, являющихся основанием для исключения из выборки, проведение антропометрического обследования, регистрация показателей вариабельности сердечного ритма, забор крови для молекулярно-генетического тестирования.

Выделение геномной ДНК из цельной венозной крови, взятой из локтевой вены добровольцев в пробирки с консервантом (ЭДТА) проводили стандартным методом фенол-хлороформной экстракции. Для определения концентрации выделенной ДНК в образцах использовали спектрофотометр NanoDrop 2000c (Termo Scientific, USA). Последующее генотипирование полиморфизмов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени осуществляли на базе лаборатории Молекулярной генетики человека кафедры медико-биологических дисциплин НИУ БелГУ (руководитель – проф., д.м.н. М.И. Чурносов).

Для регистрации вариабельности кардиоритма использовали комплекс «Варикард» (Россия) и программное обеспечение VARICARD-KARDi. В связи с тем, что на показатели вариабельности сердечного ритма значимое влияние оказывают самые разнообразные факторы, такие как, например, состояние здоровья, пол, стресс, температура, циркадные ритмы и пр., то для получения надежных и воспроизводимых результатов анализа вариабельности сердечного ритма исследование было проведено в соответствии с классическими стандартами. Предварительное анкетирования добровольцев было направлено на изучение семейного анамнеза (наличие сердечно-сосудистых, бронхо-легочных, метаболических заболеваний, недавно перенесенных инфекционных заболеваниях, употреблении лекарственных средств и т.д.), режима двигательной активности добровольцев. Исследование параметров вариабельности сердечного ритма проводили в утренние часы, при комфортной температуре, в спокойной обстановке, в лаборатории с минимальным количеством людей. Респонденты предварительно были ознакомлены с проводимой процедурой.

У испытуемых регистрировались показатели вариабельности сердечного ритма во временной и частотной областях. Помимо этого, определялось отношение низкочастотного и высокочастотного компонентов вариабельности сердечного ритма (LF/HF, усл. ед.).

Статистический анализ результатов исследования проводили стандартными методами математической статистики в программе «Statistica 7.0» [22]. Для проверки нормальности полученных количественных данных использовали тесты Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова. Нормально распределенные переменные представлены как средние (М)±m стандартная ошибка среднего значения, а в случае отклонения от нормального распределения как медиана (Me) и межквартильный диапазон [Q₁25%; Q₂75%]. Несвязанные выборки были проверены с помощью U-критерия Манна-Уитни. Статистически значимым считалось значение p = 0,05; 0,01; 0,001.

Расчет частот генотипов и аллелей, проводили используя калькулятор, представленный на medstatistic.ru. Критерий χ² Пирсона использовался для проверки соответствия распределения генотипов равновесию Харди–Вайнберга (при p>0,05 равновесие выполняется).

Результаты и их обсуждение. На основании молекулярно-генетического тестирования локуса -786Т>C (rs20770774) NOS3 популяции мужчин-северян было установлено следующее распределение генотипов: -786 Т/Т – 40,95%, -786 Т/С – 47,24% и -786 С/С – 11,81%. Данное распределение соответствовало закону равновесия Харди- Вайнберга (χ²=0,13; р=0,714). В генофонде популяции жителей-северян в результате генотипирования были выявлены два аллельных варианта гена NOS3 (rs2070744): предковый вариант NOS3*Т и мутантный аллель NOS3*С. Аллельный вариант NOS3*С являлся минорным и встречался с частотой 35,43%, как и гомозиготный генотип С/С. Частота встречаемости аллельного варианта NOS3*Т преобладала и составила 64,57%. Уровень аллельного разнообразия по исследуемому локусу – Н_о=0,44. Полученные данные по распределению частот генов и генотипов в обследуемой популяции жителей-северян сходны с таковыми у европейцев, согласно общемировым базам данных [23, 24].

Для последующего анализа мы разделили исследуемую когорту на 2 группы в соответствии с наличием в генотипе аллельного варианта NOS3*С: 1-я группа – гомозиготы Т/Т (n=52) и 2-я группа – носители аллельного варианта NOS3*С – с генотипами Т/С+С/С (n=73). Проведение антропометрического тестирования не выявило значимых различий двух групп по соматометрическим характеристикам. Так в первой группе обследуемых средняя длина тела составила 178,4±1,0 см, масса тела – 84,2±1,8 кг; средняя длина тела и масса тела мужчин-северян второй группы равнялась 178,1±0,9 см и 81,9±1,6 кг соответственно. Показатели вариабельности сердечного ритма в популяции мужчин-северян с различными генотипами по полиморфизму 786T>C (rs2070744) гена NOS3 представлены в таблице 2.

Сравнение двух групп не выявило значимых различий относительно показателей ЧСС, RMSSD, Mo и AMo50. Однако у мужчин-северян носителей полиморфного варианта NOS3*С (rs2070744) 2 группы (с генотипами Т/С+С/С) значимо более низкие величины MxDMn, pNN50, SDNN, относительно гомозигот Т/Т. Данные показатели коррелируют с активностью парасимпатической нервной системы и могут отражать состояние снижения уровня функционирования синусно-предсердного узла и изменения тонуса блуждающего нерва, что в целом свидетельствует о падении активности контура автономной регуляции сердечного ритма. Согласно литературным данным [25], одним из маркеров, характеризующих напряжение в работе регуляторных систем организма, является показатель стресс-индекса (SI). Необходимо отметить, что в целом в исследуемой выборке жителей-северян данный показатель приближается к верхней границе нормы, что может свидетельствовать о высокой степени выраженности адаптационного ответа организма при воздействии различных стрессоров среды, ведущих к перенапряжению в работе регуляторных систем организма. Более того, в группе жителей-северян носителей полиморфного варианта NOS3*С (rs2070744) (генотипы Т/С+С/С) отмечаются значимо более высокие величины стресс-индекса. Повышение уровня индекса стресса при снижении показателя pNN50 могут свидетельствовать о высоком уровне «экологического стресса» и усилении активности симпатической нервной системы.

Показатель общей мощности спектра, который является индикатором суммарного уровня активности регуляторных систем организма, статистически значимо выше в первой группе обследуемых гомозиготных носителей предкового аллеля NOS3*Т (генотип Т/Т). При этом выявленные различия обусловлены значимо более высокими величинами VLF-составляющей ритма с отсутствием значимых межгрупповых отличий относительно HF и LF. Следует отметить, что значимых отличий по показателям LF/HF и IC между двумя группами не обнаружено..

Результаты анализа основных параметров вариабельности сердечного ритма показали различия в обеспечении вегетативной регуляции сердца в зависимости от наличия полиморфизма -786T>C (rs2070744) гена NOS3. Так более высокие величины вариационного размаха, индексирующие вариативность значений кардиоинтервалов, обусловленных физиологической дыхательной аритмией наблюдались у обследуемых гомозигот с генотипом Т/Т (786T>C (rs2070744) гена NOS3. Показатель pNN50 коррелирует с активностью парасимпатической нервной системы и в настоящее время используется для оценки ее активности в качестве маркера вариабельности сердечного ритма во временной области [26]. В настоящем исследовании установлены значимые различия ряда параметров вариабельности сердечного ритма у жителей-северян носителей полиморфного варианта NOS3*С (rs2070744) (генотипы Т/С+С/С). Во-первых, в данной группе значимо более низкие показатели pNN50 и SDNN, что может свидетельствовать о снижение роли вагусного влияния в вегетативном контроле сердечно-сосудистой системы. Во-вторых, в данной когорте обследуемых выявлены более высокие показатели SI, индексирующие относительное увеличение симпатической активности в регуляции сердечного ритма (различия статистически значимые). При этом обследуемые двух групп не имели отличий относительно показателей ЧСС, RMSSD, Mo и AMo.

В наших исследованиях установлено, что значимо более высокий показатель TP, отражающий суммарную активность регуляторных систем организма, в группе гомозигот Т/Т, обеспечен значимо более высоким вкладом VLF-cоставляющей кардиоритма. Обследуемые двух групп не имели отличий относительно высокочастотного (HF) и низкочастотного (LF) диапазона общего спектра с соответствующим отсутствием отличий и относительно величины LF/HF.

Необходимо отметить, что до сих пор однозначного ответа относительно физиологических основ показателя VLF не получено. Так, в некоторых исследованиях указывается на то, что очень низкая частота общего спектра, вероятно, может быть задействована в очень медленно действующих биологических процессах организма, таких, как регуляция температуры [27], ренин-ангиотензиновые воздействия на сердце [27, 28, 29], а также может генерироваться физической активностью [30]. Согласно работам А. Н. Флейшмана (1999): «снижение мощности в VLF-диапазоне может являться чувствительным индикатором наличия энергодефицитного состояния в организме (гипоксия, метаболические нарушения) и, в свою очередь, отражает связь автономных (сегментарных) уровней регуляции с надсегментарными» [31]. При этом показано, что уменьшение очень низкочастотных колебаний кардиоритма связано с повышенным риском сердечной смерти и нарушения ритма [32]. По данным других исследований низкая мощность в этом диапазоне была связана с высоким уровнем воспаления [33]. Также было высказано предположение, что VLF компонент общего ритма в значительной степени связан с механизмами, зависящими от кальциевых каналов L-типа, генерируемыми миогенными сосудистыми реакциями на спонтанно возникающие нарушения артериального давления [34].

Учитывая тот факт, что в группе носителей варианта NOS3*С (rs2070744), были отмечены значимо более низкие показатели VLF-составляющей обшей мощности спектра, наши результаты дают нам основание предполагать, что низкое значение VLF может представлять собой ранний неинвазивный биомаркер снижения эндотелиальной функции продукции окиси азота как предиктора высокого риска сердечно-сосудистых заболеваний и снижения качества жизни в целом.

Следует подчеркнуть, что у обследуемых мужчин-северян вне зависимости от генотипа отмечаются повышенные, относительно принятой нормы величины индекса централизации (IC) (нормативный диапазон: 0,3-2,5) [35], что может свидетельствовать о превалирующем влиянии церебральной эрготоропной системы на регуляцию сердечного ритма.

Анализ параметров вариабельности сердечного ритма является хорошо известным неинвазивным методом определения функционирования вегетативной нервной системы. При этом активация симпатического отдела вегетативной нервной системы обеспечивает адаптацию организма к изменяющимся условиям среды, а преобладание парасимпатического звена способствует восстановлению гомеостаза [3]. В нашем исследовании жителей-северян установлено, что в зависимости от наличия в генотипе аллельного варианта NOS3*С (rs2070744) наблюдается сдвиг баланса симпатической и парасимпатической регуляции вариабельности сердечного ритма. Так в группе гомозиготных носителей аллельного варианта NOS3*Т (rs2070744) наблюдается активация парасимпатического звена вегетативной нервной системы, о чем свидетельствуют значимо более высокие показатели MxDMn, pNN50 на фоне низких показателей стресс-индекса (SI). Полученные результаты в полной мере согласуется с литературными данными, в которых указывается на то, что ингибирование работы эндотелиальной синтазы окиси азота (NOS3) устраняет тонизирующий возбуждающий эффект окиси азота на активность блуждающего нерва [36]. Также учитывая тот факт, что, согласно литературным данным [37]: индекс вариабельности сердечного ритма во временной области – SDNN, наряду с показателями вариабельности кардиоритма в частотной области – TP и VLF, отражают по большей части показатели функциональной способности, а не вегетативной активности, мы можем предположить о более высоком уровне функциональных резервов у гомозигот Т/Т. Необходимо подчеркнуть, что вегетативный профиль, характеризующийся вегетативным дисбалансом с высокой симпатической активностью и относительно низкой парасимпатической активностью, отмечающийся в группе Т/С+С/С, является одним из предполагаемых механизмов, лежащих в основе повышенного риска неблагоприятных соматических последствий для здоровья, таких как сердечно-сосудистые заболевания, гипертония, диабет и инсульт, а также смертность от всех причин. Тогда как большая активность блуждающего нерва защищает сердечно-сосудистую систему и связана с общим улучшением здоровья [38] и является признанным предиктором долголетия. Снижение его активности с возрастом рассматривается как естественное уменьшение функциональных резервов [7, 39].

Заключение. В целом, результаты исследования убедительно свидетельствуют о том, что наличие в генотипе даже одного аллеля NOS3*С по полиморфизму 786T>C (rs2070744) оказывает отрицательное влияние на сердечный вегетативный профиль, проявляющийся сдвигом вегетативной нервной регуляции в сторону симпатической активности. При этом полученные в ходе нашего исследования данные дают нам основание предполагать, что низкое значение VLF может представлять собой ранний неинвазивный биомаркер снижения функций эндотелиальной синтазы окиси азота как предиктора высокого риска сердечно-сосудистых заболеваний и снижения качества жизни в целом.

Информация о финансировании

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ, проект №23-15-20001