Введение. Ключевым моментом фармацевтического производства в процессе переработки лекарственного растительного сырья является внедрение малоотходных технологий, поэтому в настоящее время перспективным направлением является комплексная переработка сырья, основанием для которой служит его разноплановое химическое изучение.

Вещества липофильной природы (каротиноиды, хлорофилл) являясь важнейшими структурными элементами клеток, принимают активное участие в различных метаболических, регуляторных и обменных процессах, в связи с чем, несомненно, представляют интерес в плане фармакологической активности.

По данным литературных источников хлорофилл обладает широким спектром биологического действия, проявляет усиливающее действие на процессы кроветворения, антимикробную активность, оказывает тонизирующее действие, регулирует работу сердца, нервно-мышечного аппарата, дыхательного центра и др. [6].

Каротиноиды являясь предшественником витамина А обладают достаточ­но большим перечнем важных фармакологических свойств, таких как антиокси­дантная, радиопротекторная, фотопротекторная, антиканцерогенная и имму­номодулирующая активности [2].

Таким образом, изучение липофильного комплекса является актуальной и перспективной задачей.

Объекты и методы исследования. Объектом исследования служили образцы воздушно-сухой измельчённой надземной части одуванчика лекарственного, заготовленные в Алтайском крае (2013-2016 гг.) в различные фазы вегетации: бутонизация, цветение, плодоношение.

Определение содержания суммы липофильных веществ проводили гравиметрическим методом, следующим образом – 5.0 г  (точная навеска) измельченного сырья помещали в коническую колбу вместимостью 100 мл с притёртой пробкой. С помощью пипетки заливали 25 мл ацетона. Далее проводили экстракцию, при периодическом перемешивании, в течение 1.5 ч. Экстракцию новыми порциями ацетона повторяли несколько раз – до обесцвечивания экстракта. Объединённые ацетоновые экстракты отфильтровывали через бумажный фильтр. Затем 10 мл экстракта помещали в предварительно взвешенную выпарительную чашку, упаривали на водяной бане и высушивали в сушильном шкафу при 100–105°С в течение 30 мин. Чашку охлаждали в эксикаторе и взвешивали. Содержание суммы липофильных веществ, в пересчете на абсолютно сухое сырье рассчитывали по формуле Ветровa [1]:

Качественный анализ составляющих липофильную фракцию веществ проводили  методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в соответствии с ОФС 1.2.1.2.0003.15 «Тонкослойная хроматография» ГФ XIII издания в следующих условиях: хроматографические пластинки марки «Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ» (Краснодар, РФ) размером 5×10 см с алюминиевой подложкой, элюент: I – гексан-бензол (29:1), II – ацетон-петролейный эфир (3:7) во избежание обесцвечивания хроматографических зон камеру затемняли черной бумагой, проявитель не использовали [7]. Хроматографирование проводили в нескольких повторностях.

Идентификацию веществ на хроматограммах осуществляли в видимом и УФ-свете (365 нм) по характерному цвету зон и величинам коэффициента подвижности (Rf), описанным в литературе [5].

С дубликатных хроматограмм каждое обнаруженное пятно каротиноидов и хлорофилла вырезали, измельчали и элюировали: каротин – хлороформом, ксантофиллы – спиртом этиловым.

Спектральные характеристики элюатов регистрировали на спектрофотометре СФ-2000 (РФ) в диапазоне длин волн 200–900 нм.

Определение содержания суммы каротиноидов и хлорофиллов проводили методом прямой спектрофотометрии. Около 2.0 г (точная навеска) сырья, измельчённого до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещали в плоскодонную колбу со шлифом вместимостью 100 мл и экстрагировали 50 мл 70% этилового спирта в течение 30 мин. После охлаждения извлечение декантировали и фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Остаток в колбе заливали 50 мл 70% спирта этилового и экстрагировали еще раз в течение 30 мин. Объединённые извлечения в мерной колбе доводили 70% этиловым спиртом до метки (раствор А). 4 мл раствора А переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем 95% этиловым спиртом до метки (раствор Б). Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре СФ-2000 (РФ) в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 443±3 нм (каротиноиды в пересчете на виолоксантин) и 667±1 нм (хлорофиллы). Раствором сравнения служил 95% этиловый спирт. Содержание суммы каротиноидов и хлорофилла в процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляли по формулам (1 и 2) соответственно [4]:

Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с  требованиями ОФС 1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» ГФ ХIII издания [2].

Результаты и их обсуждение. Полученные липофильные фракции представляли собой смолистые жидкости зелёно-коричневого цвета, с характерным запахом, нерастворимые в воде и спирте, растворимые в хлороформе, гексане, этилацетате.

Результаты определения выхода липофильной фракции по фазам вегетации представлены в табл. 1.

Таблица 1

Результаты определения динамики накопления суммы липофильных соединений в траве Taraxacumofficinale

Table 1

The results of the dynamics of the accumulation of the amount of lipophilic compounds in Taraxacum officinale herb

Примечание*: n=5, P=95%, t_p=2.78, в пересчёте на абсолютно-сухое сырье

Чтобы избежать окисления, предотвращения фотоизомеризации и деградации каротиноидов подготовка образцов для анализа проводилась при охлаждении льдом и в темноте.

При исследовании липофильной фракции методом ТСХ наличие каротиноидов определяли по характерным жёлто-оранжевым и жёлтым окраскам пятен.

Хлорофиллы на хроматограммах в видимом свете имели сине-зелёное окрашивание и розовую флуоресценцию в УФ-свете (рис. 1).

В виду того, что β-каротин имеет яркий жёлто-оранжевый цвет, обусловленный наличием в структуре его молекулы системы сопряжённых двойных связей, идентификацию на хроматограмме возможно проводить визуально, без применения каких-либо детектирующих реагентов. В отличие от хлорофиллов каротиноиды не поглощают красные лучи и не обладают способностью к флуоресценции, поэтому их зоны на хроматограммах приобретают только более тёмную, т.е. коричневую окраску.

Кроме зоны β-каротина, идентифицированной в системе I по величине Rf (0.37±0.01), обнаружены и другие хроматографические зоны каротиноидов с величинами коэффициентов подвижности 0.51±0.02 и 0.82±0.02, постепенно исчезающие под действием света.

При изучении извлечений, приготовленных с помощью ацетона (1) и гексана (2) с использованием подвижной фазы II идентифицировали: β-каротин (Rf 0.98±0.01, окраска в видимом свете жёлто-оранжевая),  хлорофилл a (Rf 0.94±0.01), хлорофилл b (Rf 0.84±0.02) и неизвестный хлорофилл (Rf 0.16±0.01) с окрасками идентичными хлорофиллу а, но более светлых оттенков. Помимо этого в области  значения Rf  0.80±0.02 проявлялось жёлтое пятно ксантофилла, более интенсивное в ацетоновом извлечении. Хроматографическое поведение, т.е. характер флуоресценции ещё трёх зон адсорбции и их коэффициенты подвижности (Rf 0.56±0.01; 0.49±0.02; 0.44±0.02) позволили также их отнести к группе ксантофиллов.

Дальнейшую идентификацию  компонентов каротиноидного комплекса травы одуванчика лекарственного проводили по спектрам поглощения соответствующих элюатов.

Спектры поглощения каротиноидов в большинстве случаев характеризуются наличием трёх максимумов поглощения или двух максимумов поглощения и плеча в интервале длин волн от 270 до 550 нм (рис. 2).

Идентификацию полученных электронных спектров проводили в соответствии с литературными данными, результаты представлены в  таблице 2.

Максимумы поглощения в диапазоне 413–422, 440–456, 472–482 нм соответствуют спектрам каротиноидов.

Важной особенностью спектра поглощения хлорофилла a и b служит наличие у них двух ярко выражен­ных максимумов: в красной при 660 и 640 нм и в сине-фиолетовой областях спектра – при 420 и 450 нм соответственно.

Таблица 2

Спектральная и хроматографическая характеристики пигментов травы

Taraxacum officinale

Table 2

The spectral and chromatographic characteristics of pigments of Taraxacum officinale herb

Примечание: * подвижная система ацетон-петролейный эфир (3:7)

В результате количественной оценки площади хроматографических зон и значения оптической плотности предположили что основными каротиноидами в траве одуванчика лекарственного являются: β-каротин, лютеин, виолоксантин и тараксантин (рис. 2).

Каротиноиды играют роль вспомогательных светособирающих пигментов, их спектры поглощения характеризуются двумя полосами в  фиолетово-синей и синей области от 400 до 500 нм, т.е. в той части солнечного спектра, где слабо поглощает хлорофилл. Учитывая данный факт, количественное содержание суммы каротиноидов и хлорофилла определяли по модифицированной методике спектрофотометрическим методом (рис. 3), используя в качестве аналитических длину волны 443±3 нм максимально соответствующую максимумам поглощения идентифицированных каротиноидов и 667±1 нм для хлорофилла.

Результаты количественного определения представлены в таблицах 3 и 4.

Таблица 3

Результаты определения динамики накопления суммы каротиноидов в траве Taraxacumofficinale

Table 3

The results of determination of the accumulation dynamics of total amount of carotenoids of Taraxacum officinale herb

Примечание*: n=5, P=95%, t_p=2.78, в пересчете на абсолютно-сухое сырье

Как видно из таблицы 3, наибольшим содержанием суммы каротиноидов в пересчете на виолоксантин характеризуется фаза бутонизации (89.17 мг%), за ней следует фаза цветения (65.20%). Наименьшее же содержание показывает фаза плодоношения (52.07%).

Таблица 4

Результаты определения динамики накопления хлорофиллов в траве Taraxacumofficinale

Table 4

The results of determination of the accumulation dynamics of chlorophyll in the herb of Taraxacum officinale

Примечание*: n=5, P=95%, t_p=2.78, в пересчете на абсолютно-сухое сырье

Согласно данным таблицы 4, самое высокое содержание хлорофилла наблюдается в фазу бутонизации (0.18%), ей значительно уступают фазы цветения (0.11%) и плодоношения (0.09%).

Таким образом, несмотря на то, что общий выход липофильных веществ в фазах цветения и плодоношения, по сравнению с фазой бутонизацией больше, наибольшее накопление каротиноидов и хлорофилла наблюдается именно в фазу бутонизации. По-видимому, это связано с перераспределением других соединений составляющих липофильный комплекс.

Выводы. Методом ТСХ и спектрофотометрии в траве Taraxacum officinale идентифицированы фотосинтетические пигменты: β-каротин, лютеин, виолоксантин, неоксантин, тараксантин, хлорофилл а и хлорофилл b.

Предложенная в работе методика ТСХ может быть использована для включения в современную нормативную документацию на лекарственное растительное сырье одуванчика лекарственного.

Количественно определены сумма каротиноидов (в пересчете на виолоксантин) и хлорофилла.

Для использования сырья в качестве источника каротиноидов наиболее оптимальным  является сбор сырья в фазу бутонизации.

Полученные данные свидетельствуют о том, что трава Taraxacum officinale является перспективным источником биологически активных веществ антиоксидантной направленности. Изучаемый вид лекарственного растительного сырья может найти дальнейшее применение при использовании в клинической практике лечения заболеваний, сопровождающихся явлениями гипоксии и метаболическими нарушениями.