Введение. Гипертоническая болезнь (ГБ) относится к группе наиболее часто встречающихся заболеваний человека, характерным признаком которого служит повышенное артериальное давление (АД) [1, 2]. По данным статистических отчетов в мире за последние десятилетия (с 1990 по 2015 гг) количество индивидуумов с систолическим АД (САД) 140 мм рт. ст. и выше увеличилось на 18,59% (с 17307 до 20526 на 100 тыс. населения), показатели смертности и потери лет жизни с поправкой на инвалидность (DALYs), связанные с САД 140 мм рт. ст. и выше возросли на 8,58% (с 97,9 до 106,3 на 100 000 человек) и 49,11% (с 95,9 млн до 143,0 млн) соответственно [3]. Увеличение САД на 10 мм рт. ст. приводит к повышению риска развития ишемической болезни сердца на 45% и ишемического/геморрагического инсульта на 63-66% у индивидов в возрасте 55-64 лет [4].

Заболевание чаще регистрируется (≈20%) у мужчин, чем у женщин (стандартизированные по возрасту показатели распространенности у мужчин и женщин составляют 24 и 20% соответственно). Наряду с этим, имеются аналогичные данные о более высокой распространенности повышенного АД среди мужчин (9,2%) по сравнению с женщинами (7,8%) [5], что может быть связано как с гормональными механизмами [6], так и со средовыми факторами риска [5], обусловливающими особенности генно-средовых взаимодействий [7, 8].

Влияние наследственных факторов на возникновение ГБ изучается достаточно давно и на сегодняшний момент времени ГБ является одним из наиболее хорошо изученных заболеваний с генетических позиций [9-15]. Однако, несмотря на значительный накопленный материал по вопросу наследственных детерминант ГБ, полученный как на основе полногеномных исследований (GWAS) [7, 8, 13-16], так и с использованием «кандидатного» подхода [17-27] около 1/3-2/3 конкретных генетических факторов, связанных с развитием ГБ и ГБ-ассоциированных признаков (САД, диастолическое АД (ДАД), пульсовое АД (ПД) и др.) остаются неизвестными. Показатели наследуемости АД, оцененные на основе известных GWAS – значимых локусов (SNP-wide heritability) составляют 21,3% (САД), 21,2% (ДАД), 19,4% (ПД) и данные полиморфизмы объясняют лишь 5,66% (САД), 5,32 % (ДАД), 2,87% (ПД) дисперсии артериального давления [28]. Вместе с этим, не до конца понятны особенности генетической детерминации ГБ у мужчин и женщин. Весьма интересными представляются репликативные исследования пол-специфических особенностей ассоциаций GWAS-значимых локусов с ГБ. Так как выделение именно «значимых» по отношению к ГБ у жителей данной территории определенного пола полиморфных локусов позволит в перспективе рекомендовать именно эти полиморфизмы/гены для использования в практической медицине в качестве эффективных биомаркеров, позволяющих достаточно четко дифференцировать среди населения группу повышенного риска развития ГБ с последующей реализаций именно в этой группе комплекса мероприятий по профилактике заболевания.

Цель исследования. Установить пол-специфические особенности межгенных взаимодействий GWAS-значимых локусов, определяющих подверженность к ГБ.

Материалы и методы исследования. Данное исследование выполнено на выборке больных ГБ (n=939) и контроля (n=466) общей численностью 1405 индивидов. Выборка больных ГБ (САД≥140 мм.рт.ст.; ДАД ≥90 мм.рт.ст.) была сформирована на базе профильных отделений (кардиологии и неврологии) Белгородской областной клинической больницы Св. Иоасафа. Верификация диагноза заболевания была проведена врачами-кардиологами в соответствии с рекомендациями ВНОК. В контрольную группу были включены индивидуумы без признаков ГБ (САД<140 мм.рт.ст; ДАД<90 мм.рт.ст.), в результате профилактических осмотров, осуществлявшихся на базе поликлинического отделения областной клинической больницы. В выборки больных и контроля были включены неродственные русские жители Центрального Черноземья РФ. В группу больных не включались (критерии исключения) индивидуумы с симптоматическими/вторичными гипертензиями, тяжелыми заболеваниями печени и почек, отказавшиеся от участия в исследовании. Из группы контроля исключались индивиды с выраженными метаболическими расстройствами, тяжелыми заболеваниями печени и почек, отказавшиеся от участия в исследовании.

В соответствии с целью исследования вся изучаемая выборка нами была разделены на две подгруппы – мужчины и женщины. Выборка мужчин включала 564 больных ГБ и 257 контроля (общий объём выборки n=821), женщин – 375 больных ГБ и 209 контроля (общий объём выборки n=584).

Для генотипирования молекулярно-генетических маркеров нами использовалось ДНК, полученное из венозной крови (использовался метод фенол – хлороформной экстракции с преципитацией этанолом) При подготовке образцов ДНК к генотипированию была проведена оценка качества нуклеиновых кислот и их нормализация по концентрации. Данные процедуры были выполнены на приборе-спектрофотометре марки NanoDrop2000c (фирма производитель: Termo Scientific). В конечном итоге для экспериментального исследования была подготовлена коллекция образцов ДНК в обьеме 30-40 мкл при содержании нуклеиновых кислот (ДНК) 10-20 нг в 1мкл и «входном» параметре 1,7-2,0 (измерение осуществлялось при А260/А280).

Проведено экспериментальное исследование (генотипирование) десяти полиморфизмов десяти генов-кандидатов ГБ (АД), специально отобранных для настоящего исследования (критерием их включения в исследование явилось наличие ассоциации с ГБ (АД) в ранее выполненных полногеномных работах) [29, 30]. Изучены SNP следующих генов-кандидатов ГБ: AC026703.1-rs1173771, HFE-rs1799945, BAG6-rs805303, PLCE1-rs932764, OBFC1-rs4387287, ARHGAP42-rs633185, CERS5-rs7302981-, ATP2B1-rs2681472, TBX2-rs8068318, RGL3-rs167479. Генотипирование вышеуказанных полиморфизмов было выполнено на амплификаторе марки CFX96 [31] и наборах реагентов ООО «Тест-Ген» (г. Ульяновск) по методике, описанной нами ранее [32].

Для решения задачи, связанной с выявлением межгенных взаимодействий, определяющих подверженность к ГБ у мужчин и женщин, нами использовался метод MB-MDR [33]. Вычисления выполнены в программном ресурсе MB-MDR (среда R для Windows 7). Валидация полученных результатов моделирования проведена пермутационными процедурами (проводилось 1000 пермутаций). При оценке статистической значимости результатов анализа ассоциаций в этом разделе диссертационного исследования нами использовалась поправка Бонферрони равная n=2 в соответствии с количеством рассматриваемых пар сравнения: мужчины (больные-контроль) и женщины (больные-контроль). Исходя из этого за статистически значимый уровень в этом разделе работы нами бы принят p_perm≤0,025. В конечном итоге нами были отобраны по одной наилучшей модели межгенных взаимодействий (с максимальными значениями показателя Вальда – Wald st.), определяющих подверженность к ГБ у мужчин и женщин, которые далее мы визуализировали (в виде дендрограммы и графа) методом MDR в одноименном программном продукте, что позволило оценить конкретный процентный вклад как отдельных локусов, так и парных межгенных взаимодействий в энтропию признака (ГБ).

Результаты и их обсуждение. Анализ распределения генотипов в изучаемых группах мужчин и женщин (больные и контроль) не выявил отклонений от ожидаемого распределения при выполнении закона Харди-Вайнберга с учетом принятого за статистически значимый уровень p_HWE≤0,025 (Табл. 1, Табл. 2).

Установлено, наилучшей моделью, определяющей подверженность к ГБ у мужчин, является четырехлокусная модель с показателем Wald st. = 32,12 (р_perm=0,001). Данная модель включает локусы rs932764-PLCE1 × rs7302981-CERS5 × rs1799945-HFE × rs8068318-TBX2. Все четыре комбинации генотипов в рамках этой модели имеет протективное значение для развития ГБ у мужчин: rs932764-GG-PLCE1×rs7302981-GG-CERS5× rs1799945- CC-HFE×rs8068318-TC-TBX2 (beta = -1,75 р=0,047), rs932764-AG-PLCE1×rs7302981-AA-CERS5×rs1799945-CC-HFE×rs8068318-CC-TBX2 (beta = -0,69 р=0,032), rs932764-GG-PLCE1×rs7302981-AA-CERS5×rs1799945-CC-HFE×rs8068318-CC-TBX2 (beta = -1,69 р=0,001), rs932764-GG-PLCE1×-rs7302981-GA-CERS5× rs1799945-CG-HFE ×rs8068318-CC-TBX2 (beta = -2,13 р=0,002).

Среди женщин наиболее выраженный фенотипический эффект по отношению к ГБ проявляет четырехлокусная модель, включающая полиморфные локусы rs932764-PLCE1 × rs8068318-TBX2 × rs1173771-AC026703.1 × rs167479-RGL3 (Wald st. = 33,53 р_perm<0,001). В рамках данной модели выявлены три комбинации генотипов, связанных с развитием ГБ у женщин протективной направленности: rs932764-AG-PLCE1 × rs8068318-TC-TBX2×rs1173771-GA-AC026703.1×rs167479-TG-RGL3 (beta = -1,10 р=0,008), rs932764-AA-PLCE1×rs8068318-CC-TBX2×rs1173771-GG-AC026703.1 × rs167479-GG-RGL3 (beta = -2,10 р=0,050), rs932764-AG-PLCE1×rs8068318-CC-TBX2×rs1173771-GA-AC026703.1×rs167479-GG-RGL3 (beta = -0,77 р=0,050).

На рисунках 1 и 2 представлены графические данные по вышеуказанным моделям межлокусных взаимодействий. Наиболее существенный вклад в подверженность к ГБ у мужчин, как свидетельствуют материалы рисунка 1, вносит двухлокусное синергетическое взаимодействие rs1799945-HFE × rs8068318-TBX2, которое определяет 0,76% энтропии признака. Полученные в работе дендрограмма и граф (рисунок 2) наиболее значимого четырехлокусного взаимодействия rs932764-PLCE1 × rs8068318-TBX2 × rs1173771-AC026703.1 × rs167479-RGL3 (Wald st. = 33,53), ассоциированного с ГБ, указывают на то, что вклад парного синергетического взаимодействия полиморфных локусов rs8068318 TBX2 × rs167479 RGL3 в энтропию заболевания у женщин является наиболее максимальным и равен 2,26%.

Таким образом можно отметить, что два локуса – rs932764-PLCE1 и rs8068318-TBX2 – определяют подверженность к ГБ в составе четырехлокусных моделей межгенных взаимодействий как у мужчин, так и у женщин. Остальные два локуса, входящие в состав этих моделей межлокусных взаимодействий, у мужчин и женщин различаются. У мужчин «специфическими» локусами являются rs7302981-CERS5 и rs1799945-HFE, у женщин – rs1173771-AC026703.1 и rs167479-RGL3. При этом наибольший эффект в подверженность к заболеванию у мужчин вносит двухлокусное взаимодействие rs1799945-HFE × rs8068318-TBX2 (0,76% энтропии признака), а у женщин – rs8068318 TBX2 × rs167479 RGL3 (2,26% энтропии признака).

Следует отметить, что наши данные о значимой роли межгенных взаимодействий rs1799945-HFE в формировании подверженности к ГБ у мужчин согласуются с многочисленными материалами ранее проведенных полногеномных исследований [8-11, 34, 35, 36]. Для данного локуса были проведены и репликативные исследования [36]. В работе, проведенной в финской когорте, состоящей из 50-летних мужчин и женщин (выборка включала 399 случаев ГБ и 751 индивидов контрольной группы из когорты исследования сердечно-сосудистого риска среди взрослого населения TAMRISK) было установлено что индивидуумы, содержащие в генотипе G-аллель rs1799945 имели 1,4-кратный риск развития артериальной гипертензии в возрасте 50 лет по сравнению с носителями генотипа CC [37]. У пациентов с ожирением (индекс массы тела > 30 кг/м²) риск развития артериальной гипертензии был еще выше (OR=4,15) [37]. Имеются данные о связи rs1799945 с развитием не только ГБ, но и ишемической болезни сердца: носители аллеля G имеют на 6% более высокий риск возникновения данной сердечно-сосудистой патологии [38]. Интересно отметить, что GWAS (репликативные) данные получены для популяций разного этнического состава, что может указывать на «универсальность» полиморфизма rs1799945 гена HFE как биомаркера ГБ/повышенного АД в разных популяциях.

Вместе с этим, в широкомасштабной исследовании, проведенном Gill D. et al., обнаружена, с одной стороны, связь rs1799945 гена HFE наряду с еще двумя полиморфизмами (rs1800562 HFE и rs855791 TMPRSS6) с показателями, характеризующими уровень сывороточного железа (насыщение сыворотки железом, ферритином и трансферрином, уровень трансферрина), с другой стороны, с помощью метода менделевской рандомизации, продемонстрирован «причинный» эффект этих полиморфизмов на развитие анемии и гиперхолестеринемии, что может иметь значение в патогенезе ГБ [39].

В ранее проведенных исследованиях продемонстрировано достаточно большое число ассоциаций полиморфизма rs1173771 (G/A) гена AC026703.1 (как самостоятельно, так и при взаимодействии с курением), подтвержденных на полно-геномном уровне, с показателями САД, ДАД, среднего и пульсового АД, риском развития ГБ [8, 9, 12, 35, 36, 40, 41]. Следует отметить, что, согласно нашим результатам, данный полиморфизм в составе межгенных взаимодействий определяет подверженность к ГБ у женщин. Имеются GWAS материалы о связи а rs1173771 (G/A) гена AC026703.1 с такими АД-ассоциированными фенотипами как антропометрические показатели (рост, окружность бедер) [42, 43].

Важно подчеркнуть, что ряд полиморфизмов, находящихся в неравновесии по сцеплению с rs1173771 (G/A) гена AC026703.1, так же ассоциированы с уровнем артериального давления: rs1173766 [12, 40, 44, 45], rs1177764 [46], rs1177765 [12, 47], rs10059884 [7, 46], rs12656497 [16, 34, 45].

В работе Абрамовой М.Ю., посвященной изучению генетических детерминант преэклампсии по той же панели локусов как и в нашей работе (10 GWAS значимых для ГБ полиморфизмов) была показана важная роль межгенных взаимодействий преимущественно полиморфных локусов rs7302981 CERS5 и rs932764 PLCE1 в формировании преэклампсии у женщин Центрального Черноземья РФ (входят в состав более 50% из 10 наиболее значимых моделей межгенных взаимодействий, ассоциированных с преэклампсией) [29, 30]. В нашей работе так же показана существенная роль межгенных взаимодействий этих полиморфизмов как при формировании ГБ у женщин (rs932764 PLCE1), так и у мужчин (rs932764 PLCE1, rs7302981 CERS5).

В литературе имеются убедительные данные о более высокой распространенности повышенного АД среди мужчин (9,2%) по сравнению с женщинами (7,8%) [5]. Показатель потери лет жизни с поправкой на инвалидность (Disability-Adjusted Life-Years) (DALYs), связанные с САД≥140 мм.рт.ст. у мужчин (82,915 млн) существенно превышает (в 1,38 раза) аналогичный показатель у женщин (60,122 млн.) [3]. Еще более выраженные различия (в 1,44 раза) между мужчинами (125,124 млн.) и женщинами (86,692 млн.) наблюдаются по показателю DALYs, связанному с САД≥110-115 мм.рт.ст. [3].

Опубликованные материалы о причинах, лежащих в основе пол-специфических особенностей распространенности ГБ весьма многочисленны. Показано преобладание среди мужчин в сравнении с женщинами таких факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний как диета с высоким содержанием натрия и низким содержанием фруктов, курение, употребление алкоголя и наркотиков, высокий уровень глюкозы в плазме крови натощак [5]. Таким образом, более выраженная экспозиция средовых факторов риска у мужчин, чем у женщин может оказывать существенное модифицирующее влияние на реализацию наследственной предрасположенности к заболеванию. Значимая роль генно-средовых взаимодействий (SNP с курением, приемом алкоголя) в характере ассоциаций полиморфизма генов-кандидатов с ГБ (rs633185 ARHGAP42, rs1799945 HFE, rs1173771 AC026703.1 и др.) была показана в ранее проведенных полно-геномных исследованиях [7, 8, 28]. Наряду с этим важную роль в подверженности к ГБ играют половые гормоны (считается, что эстрогены оказывают протективное влияние на развитие заболевания), которые также могут являться значимыми «модификаторами» в фенотипическом проявлении генов-кандидатов ГБ [6].

Заключение: Межгенные взаимодействия GWAS значимых для ГБ локусов являются пол-специфическими: у мужчин подверженность к ГБ определятся межлокусным взаимодействием rs932764-PLCE1, rs7302981-CERS5, rs1799945-HFE, rs8068318-TBX2 с наиболее выраженным эффектом двухлокусного взаимодействия rs1799945-HFE × rs8068318-TBX2 (0,76% энтропии), а среди женщин – межгенным взаимодействием rs932764-PLCE1, rs8068318-TBX2, rs1173771-AC026703.1, rs167479-RGL3 с максимальным вкладом в энтропию заболевания (2,26%) парного взаимодействия rs8068318 TBX2 × rs167479 RGL3.

Информация о финансировании

Финансирование данной работы не проводилось.